Agrobacterium-mediert genoverføring i planter | Bioteknologi (med diagram)

Agrobacterium-mediert genoverføring i planter!

Agrobacterium er en gram-negativ patogen bakterie som er involvert i å forårsake krongalldannelses sykdom hos plantearter. Kronegalldannelsen skyldes overføringen av et segment av onkogen (kreftfremkallende) DNA inn i plantecellen ved sårede steder.

Dette DNA-segmentet (overførings-DNA eller T-DNA) er tilstede på stort plasmid kalt Tumor-inducerende (Ti) plasmider i bakterien. T-DNA (ca. 20 kb lang) er integrert i plantekromosomet ved rekombination. En serie virulens (vir) gener er involvert i styring av infeksjonsprosessen. Så når en planterot eller en stamme blir såret, gir den avgjort svar.

Som svar på disse signalene blir virgenene av A. tumefaksjoner aktivert og styrer en rekke hendelser som kreves for overføringen av T-DNA fra Ti-plasmidet til plantens kromosom. Funksjonen til forskjellige virener inkluderer en kopi av T-DNA, etterfulgt av vedlegg av et produkt til den kopierte T-DNA-strengen for å fungere som en leder, og deretter legge til proteiner sammen med lengden av T-DNA, muligens som en beskyttende mekanisme.

Disse åpner til slutt en kanal i bakteriecellemembranen, gjennom hvilken T-DNA passerer. T-DNA kommer deretter inn i planten gjennom såret. Det er imidlertid fortsatt ikke klart hvordan det bakterielle DNA beveger seg fra cytoplasma til kjernen i plantecellen, eller hvordan T-DNA blir integrert i plantekromosomene.

For å bruke disse bakteriene som vektor blir dets T-DNA-region fjernet bortsett fra grenseområdene og vir-genene. Transgenet blir deretter satt inn mellom T-DNA-regionene, hvor det overføres til plantecelle og blir integrert i plantens kromosom (figur 1). T-DNA klones i Ti-plasmider, som er kuttet til størrelse og replikert i E. coli for å lette videre manipulasjon. Disse vektorene mobiliseres i Agrobacterium vertsstammer og brukes til å infisere plantens vev.

Disse infiserte plantevevene dyrkes deretter på media som inneholder spesifikke kjemikalier, vekstregulatorer for å lette regenereringen av transformerte celler. Utvelgelsen av transformanter blir gjort i nærvær av et antibiotikum som er tilstede i dyrkningsmediet. De transformerte plantene analyseres til slutt for stabil integrasjon og funksjonell analyse av det innsatte genet.

Protoplast Fusion:

Celler uten cellevegg refereres til som protoplaster. Disse protoplaster kan oppta DNA direkte i nærvær av visse kjemikalier (som polyetylenglykol, PEG). Høyere konsentrasjon av PEG forårsaker permeabilisering av plasmamembranen, som tillater opptak av DNA i protoplaster. Selv elektriske signaler kan brukes til å lage små hull i plasmamembranen ved å lede en elektrisk strøm.

Dette er kjent som elektroporasjon. Disse små åpningene hjelper deretter med utenlandske DNA-opptak av protoplaster. Dette følges deretter av celleveggdannelse og initiering av celledeling. Imidlertid er produksjonen av transgene planter ved direkte genoverføring til protoplaster avhengig av et effektivt system av protoplast til planteregenerering.

Gene-gun eller Biolistic Gene Transfer:

Dette er den nyeste teknikken hvor man kan levere DNA av interesse til en celle ved å laste mikropartikler (som gull eller wolfram) ved høy hastighet. Denne prosessen med å levere DNA kalles bombardement. Inne i cellen frigjøres DNA-molekyler fra partiklene og til slutt blir dette DNA integrert i vertscellens nukleare eller organelle genom.

Vevseksplanter blir til slutt dyrket på media som inneholder spesifikke hormoner / antibiotika for å velge de transformerte plantene. Når genet av interesse er overført til ønsket vert, må dens stabile integrasjon etableres, som gjøres ved å regenerere planter. Dette oppnås ved hjelp av vevskulturteknikken.

Prosessen med vevskultur kan i stor grad deles inn i fire faser:

Fase I:

Inkluderer valg av egnede eksplanteringsstoffer og overføring til næringsmedium.

Trinn II:

Inkluderer spredning av voksende vev på multiplikasjonsmediet.

Trinn III:

Inkluderer overføring av voksende vev (callus) til media der det kan skille seg inn i ulike deler.

Trinn IV:

Inkluderer overføring av planter til det naturlige miljøet. Imidlertid kan gener av interesse legges på to måter som sans og antisensorientering. For å uttrykke eller over uttrykke genet kan man sette genet i sansorientering. Men hvis man ønsker å blokkere det uønskede produktet eller et trinn i en biokjemisk vei, kan man sette genet i en antisense-orientering.