Bakterier tilstede i en prøve ved hjelp av seriell fortynning agarplateringsmetode eller Total Plate Count (TPC) Metode

Total Plate Count (TPC):

For å oppregne bakterier tilstede i en prøve ved seriell fortynning agar plating metode eller total plate count (TPC) metode.

Hensikt:

Omfanget av bakteriell aktivitet i en gitt prøve i et bestemt sett av forhold, avhenger hovedsakelig av det totale antall bakterier som er tilstede i det, uavhengig av deres art.

Derfor er det svært ofte nødvendig å finne ut totalt antall bakterier tilstede i prøver av mat, vann, jord, luft og vev under mikrobiologisk analyse. Dette totale antall bakterier inkluderer både levende og døde bakterier. ' Døde bakterier kan ikke vokse og reprodusere.

Det er bare levende bakterier (levedyktige bakterier), som kan vokse og formere seg, noe som resulterer i spesifikk bakteriell aktivitet. Derfor er det svært ofte nødvendig å oppregne de levedyktige bakteriecellene i forskjellige prøver. Imidlertid teller de fleste opptegningsmetoder som direkte mikroskopisk telling, elektroniske celleantal, kjemiske metoder og spektrofotometrisk metode både levende så vel som døde celler.

Disse metodene kan ikke diskriminere mellom levende og døde celler. Derfor, seriell fortynning-agar plating metode, som kun oppregner de levedyktige bakterie celler, er den universelt brukte metoden for å telle levende levedyktige celler i forskjellige prøver.

Prinsipp:

En bestemt vekt av fast prøve homogeniseres aseptisk i ni volumer steril saltløsning for å få en homogen suspensjon av bakterier. Væskeprøven brukes direkte som homogen suspensjon av bakterier. Suspensjonene av bakterier som er oppnådd så fortynnes serielt (10 ganger, 100 ganger, 1000 ganger etc.). Her blir 10 -1, 10 -2, 10 -3 etc. kalt fortynninger.

Deres reciprocals (10 1, 10 2, 10 3 etc.) kalles fortynningsfaktorer. Et bestemt volum av suspensjon av bakterier fra hver fortynning inokuleres på agarplater og spres ordentlig, slik at de enkelte bakteriecellene brettes i stykker fra hverandre og isolerer dem fra hverandre.

Inokuleringen av bakterier for opptellingen er gjort i to teknikker som følger:

1. Hell plate teknikk

2. Spread plate teknikk

1. Hell plate Teknikk:

I denne teknikken slippes 1 ml av bakteriesuspensjonen på en sterilisert petriskål, og deretter blir det flytende næringsmiddel-agarmedium hellet over det. Petriskålen virvles forsiktig slik at suspensjonen blandes med mediet jevnt. Det får lov å avkjøle og størkne.

2. Spread Plate Teknikk:

I denne teknikken slippes 0, 1 ml av bakteriesuspensjonen på en preparert agarplate. Derefter spredes suspensjonen jevnt på agarplaten med en sterilisert glasspreder.

For å minimere feilen blir hver fortynnet suspensjon plettet på 2-5 replikatplater. De podede platene inkuberes ved 37 ° C i 24 timer. I løpet av denne perioden vokser og isolerer hver isolert individuell bakteriecelle på agarplaten raskt og multipliserer for å produsere en makroskopisk synlig masse av bakterieceller kalt en "koloni". Antallet kolonier på platen representerer således antall bakterier i prøven.

Men svært ofte, under spredning, kan noen celler ikke skille seg ordentlig, og få slike uavskilte celler kan gi opphav til en enkelt koloni. Dessuten har få celler tendens til å forbli i par, kjeder eller klynger.

Her produserer hvert par, kjede eller klynge en koloni. Således representerer hver koloni i streng forstand ikke en eneste bakterie. Det er derfor, i stedet for å uttrykke antall bakterier som "Nei. av bakterier / gm eller ml av prøve ', uttrykkes det veldig ofte som antall kolonidannende enheter per gm eller ml (CFU / gm eller ml).

Det totale talltallet (TPC) i den opprinnelige prøven beregnes ved å multiplisere antall CPUer med de respektive fortynningsfaktorene. 'Regler for oppregning' følges, mens man beregner antall bakterier i den opprinnelige prøven.

Materialer som kreves:

Petri-tallerkener (15 nos.), 2 ml pipetter (10 nos), 10 ml pipette (1 nr.), Prøverør (10 nos.), Koniske kolber (500 ml og 1 liter-1 nr hver), 500 ml beger (2 nos.), Glasspreder, pipetter av rustfritt stål, håndverkpapir, tråd (eller gummibånd), ikke-absorberende bomull, etylalkohol, natriumklorid (NaCl), 0, 1 N saltsyre (HCI) 0, 1N natriumhydroksid (NaOH), destillert vann, nærings agar, flytende prøve (f.eks. Damvann / avløpsvann), fast prøve (f.eks. Jord / fiskekjøtt / østerskjøtt / behandlet mat), pH-papir (eller pH-meter) og mørtel (eller homogenisator), bunsenbrenner, varmluftsovn, autoklav, inkubator, laminarflytkammer, Quebec kolonisteller.

Fremgangsmåte:

1. Ti pipetter (i et rør av rustfritt stål), 15 petriskål og et par pestle og mørtel (eller en homogeniseringskopp) steriliseres i varmluftsovn ved 180 ° C i 3 timer. Alternativt kan de dekkes med fagpapir, bundet med tråd eller gummibånd og steriliseres i autoklav sammen med mediet (figur 6.6).

Antall petri-tallerkener og tilsvarende mengden av medium som skal brukes, beregnes avhengig av antall replikasjoner og fortynninger som kreves. Her er glasset og mediet tatt for enkeltreplikasjon og fortynning opp til 10 -6 . Antallet glassvarer og mengden medium tatt for sterilisering er litt mer for å unngå enhver tilfeldig feil, fordi sterilisering er en langvarig prosess.

2. 4, 25 g NaCl oppløses i 500 ml destillert vann for å få fysiologisk saltoppløsning (0, 85%). 225 ml av denne saltoppløsningen helles i en 500 ml konisk kolbe. Munnen er bomullskoblet, dekket med håndflate og festet med tråd eller gummibånd. Det brukes som de første fortynningsmidler for å fortynne den faste prøven.

3. 9, 0 ml av den resterende saltoppløsningen blir også pipettert i hvert av de 10 reagensrørene. Munnene deres er bomullspluggede, dekket med håndflate og festet med tråd eller gummibånd. Disse brukes som fortynningsmidler for seriell fortynning.

4. Ingrediensene av næringsmiddelagarmedium eller dets ferdige pulver som kreves for 500 ml av mediet, veies og oppløses i 500 ml destillert vann i en 1 liters konisk kolbe ved risting og virvling.

PH-verdien bestemmes ved bruk av pH-papir eller pH-meter og justeres til 7, 0 ved bruk av 0, 1 N HC1 hvis det er mer eller ved bruk av 0, 1N NaOH hvis det er mindre. Kolben oppvarmes for å oppløse agaret i mediet helt. Deretter er den bomullskoblet, dekket med håndflate og festet med tråd eller gummibånd.

5. Den 500 ml koniske kolben inneholdende 225 ml saltvann, de 10 reagensrørene som inneholder 9 ml saltvann hver og 1 liter konisk kolbe inneholdende 500 ml næringsmiddel-agar-medium steriliseres ved 121 ° C (15 psi trykk) i 15 minutter i en autoklav.

6. Etter sterilisering fjernes de steriliserte materialer fra autoklaven og får avkjøles i noen tid, uten at mediet størkner. Kjøling av mediet forhindrer kondensering og opphopning av vanndråper inne i platene. Hvis mediet allerede er utarbeidet og størknet under lagring, må det fortynnes ved oppvarming forsiktig til det smelter helt.

7. For å fremstille agarplater, før det steriliserte næringsmiddel agarmediet avkjøles og størkner, i varm smeltet tilstand, helles den aseptisk i de 6 steriliserte petriskålene (ca. 20 ml hver), slik at det smeltede medium dekker bunnen av petri retter helt.

Deretter dekkes platen med dekslene og får avkjøles for å størkne mediet i dem. Vanndamp som kan kondensere på den indre overflaten av platene og dekslene, blir fordampet ved å holde platene og dekslene i omvendt stilling i en inkubator ved 37 ° C i ca. 1 time.

8. 25 g av den faste prøven (f.eks. Fiskekjøtt / østerskjøtt / bearbeidet mat) vektes og homogeniseres i 225 ml sterilisert saltvann (fortynningsmiddel) aseptisk (figur 6.7). Dette gir en 10 ganger fortynning (fortynning = 10 -1 ). For væskeprøven pipetteres 1 ml prøve aseptisk i et 9 ml sterilisert saltvannsrør. Dette gir også 10 ganger fortynning (fortynning = 10 -1 ).

9. 1 ml av 10-1 fortynningen overføres til 9 ml sterilisert saltoppløsning i et annet reagensrør. Dette gir 100 ganger fortynning (fortynning = 10-2 ). Fra 10 -2 fortynningen blir 1 ml droppet i en sterilisert petriskål og 0, 1 ml på en agarplate, fra samme pipette. For hver fortynning brukes en separat sterilisert pipette. Etter bruk dyppes den i kassetten.

10. 1 ml av 10-2 fortynningen overføres til 9 ml sterilisert saltoppløsning i et annet reagensrør. Dette gir 1000 ganger fortynning (fortynning = 10 -3 ). Fra 10 -3 fortynningen blir 1 ml droppet i en sterilisert petriskål og 0, 1 ml på en agarplate, fra samme pipette. På lignende måte fortsetter fortynningen opp til 10 -6 serielt, hver gang overføring av 1 ml til en sterilisert petriskål og 0, 1 ml til en agarplate fra samme pipette.

11. Derefter spredes suspensjonsdråpene på agarplattene aseptisk ved hjelp av en sterilisert glasspreder. Etter å ha spredt seg i hver tallerken, er den flamsterilisert ved å dyppe i alkohol og vise over en flamme. Dette er "spread plate teknikken".

12. Petriskålene som inneholder 1 ml bakteriesuspensjon hver tas og sterilisert flytende nærings agar helles i dem. De svirles forsiktig, slik at suspensjonen blandes med mediet jevnt. Plattene får avkjøle til mediet størkner. Dette er "pour plate technique".

13. Plattene inkuberes deretter i omvendt stilling, topp ned ved 37 ° C i 24 timer i en inkubator (figur 6.7).

14. En un-inokulert agarplate inkuberes som kontroll for å sikre riktig sterilisering som vist ved ingen vekst på den.

observasjoner:

Antallet kolonier av bakterier på platene teller direkte eller ved hjelp av en Quebec kolonisteller. Fra dette beregnes antallet bakterier tilstede per gram eller ml av den opprinnelige prøven. Dette kalles opptelling.

Regler for opptelling:

1. Petriskål med 30 til 300 kolonier bør vurderes.

2. Gjennomsnittlig antall duplikater og tre eksemplarer (R 1, R 2 R 3 ...) anses kun hvis en teller ikke er mer enn dobbelt av den andre. Hvis en er mer enn dobbel av den andre lavere verdien er tatt.

3. For hellingsplatteteknikk er bakterieantallet No.X 10 c / gm, hvor c = fortynningsfaktor. For spredningsteknikkteknikk er bakterieantall nr. X10 c + 1 / g, hvor c = fortynningsfaktor. Tallet konverteres til to desimaler i form av (x.yz X 10 m ). For eksempel er 288 X 10 4 uttrykt som 2, 88 X 10 6 .

4. Hvis kolonienummeret i alle fortynninger er mer enn 300, teller for høyest fortynning, og hvis det i alle fortynninger er mindre enn 30, teller for at den laveste fortynningen vurderes. I begge tilfeller er tellingen representert som: Estimert nr. X 10 c / gm eller ml for pour plate teknikk og estimert nr. X 10 c + 1 / gm eller ml for spredningsteknikkteknikk.

5. Hvis ingen koloni observeres i en fortynning som er tatt, er den representert som: Estimert <1 x laveste fortynning.

6. Da seriell fortynning finner sted i form av 10 ganger, er det matematisk klart at ingen to fortynninger kan ha kolonier mellom 30 og 300. For eksempel, hvis 10 -3 har 50 kolonier, skal 10 -2 ha 500 (dvs.> 300) og 10 -4 bør ha 5 (dvs. <30) kolonier.

Dette skjer imidlertid ikke i realiteten, da bakterier ikke forekommer som en homogen løsning; fremstår som en suspensjon i fortynningsmiddelene. Hvis det er to fortynninger som har telle kolonier (mellom 30 og 300), beregnes først antall kolonidannende enheter / gm eller ml ved bruk av hver fortynning.

Hvis en verdi er mer enn dobbel av den andre, rapporterer du den laveste verdien. Hvis ikke, ta gjennomsnittet av de to verdiene og rapporter denne verdien.