Dyrking av bakterier fra faste, flytende og swab-prøver (med figur)

Hensikt:

Hovedformålene med dyrking av bakterier er som følger:

1. Øke antall bakterier for å få dem i synlige former, som kolonier eller suspensjoner.

2. Isolering av bakterier.

3. Vedlikehold av ren aksjekultur og standard kulturer.

4. Oppregning av bakterier i prøver.

5. Påvisning av bestemte bakterier av interesse for en prøve og dens oppsummering.

6. Identifisering av bakterier fra koloniegenskaper, vekstegenskaper på skråninger og biokjemiske aktiviteter i ulike medier.

Formålet med dette eksperimentet er imidlertid kun å dyrke bakterier fra væskeformige, faste og overflateprøver i faste og flytende medier for å få dem i synlige former som kolonier eller suspensjon henholdsvis.

Prinsipp:

Bakterier dyrkes i sterilisert, næringsrikt rik væske eller fast medium. Væskemidlet, som kalles kjøttkraft, finnes i reagensrør for å danne "buljongrør", mens det faste media, kalt agarmedium, finnes i petriskål for å danne "agarplater" eller bare "plater". Dyrking av bakterier trenger noe materiale, som mistenkes å inneholde bakterier.

De fleste av tingene vi ser inneholder bakterier. De er tilstede i tannskrape, mat, jord, vann, avføring og selv i de usteriliserte mikrobiologiske medier i seg selv. En bestemt mengde av den homogene suspensjonen av noe av det bakterieholdige materialet inokuleres i det steriliserte medium aseptisk og inkuberes i en inkubator ved 37 ° C i 24 timer.

I væskebuljong vokser bakteriene som suspensjon og gjør det uklart. På faste agarplater vokser de som kolonier; hver koloni vokser fra en enkelt bakterie. Dyrking av bakterier utføres i de følgende fem trinnene.

1. Fremstilling av media

2. Sterilisering av media og glassvarer

3. Inokulering

4. Inkubasjon

5. Observasjon

1. Forberedelse av media:

Vanligvis, i forberedelse av flytende buljong og halvfast medium, veies ingrediensene i de foreskrevne proporsjoner og oppløses i ønsket mengde vann. For tiden er ferdige mediepulver som inneholder ingrediensene i nødvendige mengder tilgjengelig.

Ved utarbeidelse av flytende kjøttmedium blir den foreskrevne mengde pulver (som nevnt på etiketten på pakken) veid og oppløst i den nødvendige mengde vann i en konisk kolbe. Ingrediensene oppløses ved oppvarming, helles i testrør og steriliseres i autoklav.

Men ved forberedelse av faste plater, skråninger og dype rør, blir den foreskrevne mengden pulver (som nevnt på etiketten på pakken) veid og oppløst i nødvendig mengde vann i en konisk kolbe. Dette preparerte medium steriliseres først i autoklav og får deretter avkjøles i noen tid.

Mens det fortsatt er varmt, før det størkner, blir det hellet i steriliserte petriskåler eller prøverør og tillatt å størkne ved avkjøling til romtemperatur. Medier, i meget varm tilstand, skal aldri helles i beholdere, da det fører til kondensering av vann på beholderens vegg, som faller på overflaten av mediet og kan føre til forurensning.

2. Sterilisering:

Glassvarer steriliseres i varmluftsovn ved 180 ° C i 3 timer og medier i autoklav ved 121 ° C (15 psi trykk) i 15 minutter. Glassvarer kan også steriliseres i autoklav, men media må aldri steriliseres i ovnen, ettersom vannet kommer ut av media og dehydrerer.

3. Inokulering:

Væskeprøver antas å være homogene suspensjoner av bakterier. Derfor, for dyrking i buljong, blir et bestemt volum av prøven pipettert i buljongen aseptisk. For dyrking på agarplater pipetteres et bestemt volum av prøven på den faste agarplaten og spre seg på overflaten av mediet aseptisk.

For faste prøver homogeniseres en prøve av bestemt vekt aseptisk i et bestemt volum av normal fysiologisk saltoppløsning (0, 85% natriumklorid) ved bruk av en sterilisert stamme og mørtel eller en blender. De fleste menneskelige patogener er isotoniske for menneskekroppen (0, 85% natriumklorid).

Vanligvis er forholdet mellom prøve og saltoppløsning 1: 9 (1 g + 9 ml, 10 g + 90 ml, 25 g + 225 ml eller 50 g + 450 ml). Et bestemt volum av denne homogeniserte væsken, som antas å være en homogen suspensjon av bakterier, pipetteres aseptisk til den steriliserte kjøttkraft i reagensrør for buljongkultur. For kultur på agarplater pipetteres væskesuspensjonen på overflaten av platene og spres aseptisk.

For overflateprøver tatt for å studere mikrobiologien av faste overflater (bordplater, kroppsflater eller sår), blir overflaten gnidd med en sterilisert vattpinne. Vattpinnen er berørt til overflaten av en sterilisert agarplate. Fra berøringspunktet blir streker laget av sterilisert sløyfe aseptisk, for å isolere bakteriene.

4. Inkubasjon:

De inokulerte buljongrørene og platene inkuberes ved 37 ° C i 24 timer i en inkubator.

5. Observasjon:

Turbiditet i væskebuljong og kolonier på agarplater indikerer vekst av bakterier.

Materiale som kreves:

Petri-tallerkener (6 nos.), 2 ml pipetter (5 nos.), Prøverør (5 nos.), Koniske kolber (100 ml, 250 ml og 500 ml-l hver), 250 ml beger (2 nos.), Glass sprekker, rustfritt stål pipettveske, håndverkpapir, tråd (eller gummibånd), ikke-absorberende bomull, småpinner, sløyfe, etylalkohol, natriumklorid (NaCl), 0, 1N saltsyre (HCI), 0, 1 N natriumhydroksyd (NaOH ), destillert vann, næringsbuljong, nærings agar, væskeprøve (f.eks. damvann), fast prøve (f.eks. jord), overflateprøve (f.eks bordplattform, kroppsoverflate, sår), pH-papir (eller pH-meter), pestel og mørtel (eller homogenisator), bunsenbrenner, varmluftsovn, autoklav, inkubator, laminar-strømningskammer.

Fremgangsmåte:

1. Fem pipetter (i en rustfritt stålpipettpose), seks petriskål og et par pestle og mørtel (eller en homogeniseringskopp) steriliseres ved 180 ° C i 3 timer i en varmluftsovn. Alternativt kan de dekkes med fagpapir, bundet med tråd eller gummibånd og steriliseres i autoklav sammen med media (Figur 6.1).

2. 0, 85 g NaCl oppløses i 100 ml destillert vann i et 250 ml beger og 90 ml av denne saltoppløsningen helles i en 100 ml konisk kolbe. Munnen er bomullskoblet, dekket med håndflate og festet med tråd eller gummibånd.

3. Ingrediensene av næringsmedium-kjøttmedium som kreves for 100 ml av buljongen, veies. Alternativt veies foreskrevet mengde ferdigblandet næringsbuljongpulver (ingrediensblanding).

4. Ingrediensene (eller det ferdige pulveret) oppløses i 100 ml destillert vann i en 250 ml konisk kolbe ved risting og virvling. PH-verdien bestemmes ved bruk av pH-papir eller pH-meter. PH-verdien justeres til 7, 0 ved anvendelse av 0, 1 N HCI hvis den er mer eller ved bruk av 0, 1N NaOH hvis den er mindre. Kolben oppvarmes, hvis nødvendig, for å oppløse ingrediensene helt.

5. Kjøttbøllen er fordelt i 5 reagensrør (ca. 10 ml hver), deres munn bomullstoppet, dekket med håndflate og festet med tråd eller gummibånd.

6. Ingrediensene av næringsmiddelagarmedium eller dets ferdige pulver som kreves for 200 ml av mediet, veies og oppløses i 200 ml destillert vann i en 500 ml konisk kolbe ved risting og virvling.

PH-verdien bestemmes ved bruk av pH-papir eller pH-meter og justeres til 7, 0 ved bruk av 0, 1 N HC1 hvis det er mer eller ved bruk av 0, 1N NaOH hvis det er mindre. Kolben oppvarmes for å oppløse agaret i mediet helt. Deretter er den bomullskoblet, dekket med håndflate og festet med tråd eller gummibånd.

7. Swabs er laget ved å vri bomull rundt spissene av små pinner. Få slike vattpinner holdes i et reagensrør med bomullstipsene nedover. Testrøret er bomullsplugget, dekket med håndflate og festet med tråd eller gummibånd.

8. Den 100 ml koniske kolben med 90 ml saltvann, de 5 reagensrørene med næringsvæsken, den 500 ml koniske kolben inneholdende 200 ml næringsmiddel-agar-medium og testrøret som inneholder vattpinnen blir sterilisert ved 121 ° C (15 psi trykk) for 15 minutter i en autoklav.

9. Etter sterilisering fjernes de steriliserte materialer fra autoklaven og får avkjøles i noen tid, uten at mediet kan størkne. Kjøling av mediet forhindrer kondensering og opphopning av vanndråper inne i platene. Hvis mediet allerede er utarbeidet og størknet under lagring, må det fortynnes ved oppvarming forsiktig til det smelter helt.

10. For å forberede nærings agarplater, før det steriliserte næringsmiddel agarmediet avkjøles og størkner i varm smeltet tilstand, helles den aseptisk i de 6 steriliserte petriskålene (ca. 20 ml hver) slik at det smeltede medium dekker bunnen av petriskålene helt.

Deretter dekkes platen med dekslene og får avkjøles for å størkne mediet i dem. Vanndamp som kan kondensere på den indre overflaten av platene og dekslene, blir fordampet ved å holde platene og dekslene i omvendt stilling i en inkubator ved 37 ° C i ca. 1 time.

11. Væskeprøven (antatt å inneholde bakterier, f.eks. Damvann) er tatt. En ml hver av prøvene pipetteres aseptisk i 2 buljongrør (figur 6.2). Rørene er swirled. Væskeprøven pipetteres også aseptisk på 2 agarplater, 0, 1 ml hver og spredes på overflaten av agarmediet ved bruk av en flamme-sterilisert glasspreder.

Før hver spredning av glasssprederen blir den dyppet i alkohol og flammet over en bunsenbrenner. De inokulerte buljongrørene og platene inkuberes ved 37 ° C i 24 timer i en inkubator. Platene er inkubert i omvendt stilling, topp ned.

12. For den faste prøven (f.eks. Jord) blir 10 g av prøven aseptisk veid og homogenisert i den steriliserte pestel- og mørtel- eller homogeniseringskoppen etter tilsetning av 90 ml av den steriliserte saltoppløsningen fra den 100 ml koniske kolben.

Denne homogene bakteriesuspensjonen pipetteres aseptisk i 2 buljongrør og 2 agarplater som i trinn 11 og inkuberes ved 37 ° C i 24 timer i inkubatoren (figur 6.2). Platene er inkubert i omvendt stilling, topp ned.

13. For overflateprøvetaking er overflaten som mistenkes for å inneholde bakterier (bordplate, kroppsoverflate, sår) merket for et arealområde (f.eks. 1 cm ² ) som gnides av en sterilisert vattpinne. Vattpinnen er berørt på overflaten av de to utelagte agarplatene.

Streaking er gjort aseptisk ved en flamme-sterilisert løkke. Ved strekking trekkes nesten parallelle linjer av løkken fra swab-touch-punktet. Disse danner de primære stripene. Etter flamme-sterilisering av løkken trekkes sekundære striper nesten diagonalt til de primære stripene. På lignende måte blir tertiære og kvaternære streker gjort aseptisk.

14. Plattene inkuberes deretter i omvendt stilling, topp ned ved 37 ° C i 24 timer i inkubatoren (figur 6.2).

15. En uinokulert agarplate og ett uinokulert buljongrør inkuberes som kontroll for å sikre riktig sterilisering som indikert ved ingen vekst i dem. Dette trinnet er valgfritt.