Deoksyribonukleasetest på bakterier for å finne ut deres evner til å hydrolysere DNA (med figur)

Deoxyribonuclease Test (DNase Test) på bakterier for å finne ut deres evner til å hydrolysere DNA (med figur)!

Prinsipp:

Noen bakterier har evnen til å hydrolysere deoksyribonukleinsyre (DNA) til oligonukleotider, da de kan produsere det ekstracellulære hydrolytiske enzymet 'deoksyribonuklease' (DNase).

Mens DNA'et utfelles ved saltsyrefrembringende opasitet, blir dets hydrolyserte sluttprodukter, oligonukleotider, ikke utfelt av saltsyre, for hvilke de ikke frembringer en slik opasitet; heller gi åpenhet.

I DNase-testen blir testbakteriene dyrket på agarplater som inneholder DNA. Etter at kolonier av bakteriene er synlige, overskrides platene med saltsyre. Hvis bakteriene har evne til å hydrolysere DNA, hydrolyserer dets kolonier DNA i mediet i områdene som omgir dem, mens resten av platene av platene inneholder unhydrolyserte DNA.

Som et resultat dannes der gjennomsiktige klare soner rundt koloniene når de oversvømmes med saltsyre. Da de hydrolyserte produkter, oligonukleotider som dannes rundt dem, ikke dannes utfellinger med saltsyre.

På den annen side blir resten av platensarealene ugjennomsiktige, da det ikke-hydrolyserte DNA i disse områdene danner utfelling med saltsyre. Hvis toluidinblått brukes i stedet for saltsyre, produseres en rosa rosa halo kun rundt koloniene.

Materialer som kreves:

Petriskål, konisk kolbe, bomullsplugger, inokuleringssløyfe, autoklaver, bunsenbrenner, laminarflammekammer, avfallsbeholder, inkubator, DNase-agar, IN saltsyre (eller 0, 1% toluidinblå), isolerte kolonier eller rene kulturer av bakterier.

Fremgangsmåte:

1. To petri-tallerkener rengjøres, dekkes med håndflate og festes med tråd eller gummibånd (figur 7.23). Dette trinnet samt steriliseringen av petriskålene i trinn 6 utelates dersom ovnssteriliserte petriskål brukes direkte.

2. Ingrediensene i DNase agar medium (som inneholder DNA som hovedkomponent) eller dets ferdige pulver som kreves for 100 ml av mediet, veies og oppløses i 100 ml destillert vann i en 250 ml konisk kolbe ved risting og virvling.

3. pH-verdien bestemmes ved bruk av pH-papir eller pH-meter og justeres til 7.2 ved bruk av 0, 1N HCI hvis det er mer eller ved bruk av 0, 1N NaOH hvis det er mindre.

4. Kolben oppvarmes for å oppløse agaret i mediet helt.

5. Kolben er bomullskoblet, dekket med håndflate og festet med tråd eller gummibånd.

6. De to petriskålene og den koniske kolbe inneholdende DNase agar-medium steriliseres ved 121 ° C (15 psi trykk) i 15 minutter i en autoklav.

7. Etter sterilisering fjernes de fra autoklaven og får avkjøles i noen tid, uten at mediet kan størkne. Kjøling av mediet forhindrer kondensering og opphopning av vanndråper inne i platene. Hvis mediet allerede er utarbeidet og størknet under lagring, må det fortynnes ved oppvarming forsiktig til det smelter helt.

8. For å fremstille DNase-agarplater, før det steriliserte DNase-agarmedium avkjøles og størkner, i varm smeltet tilstand, det helles aseptisk, fortrinnsvis i et laminært strømningskammer, inn i de to steriliserte petriskålene (ca. 20 ml hver), slik at Det smeltede mediet dekker bunnen av petriskålene helt.

Deretter dekkes platen med dekslene og får avkjøles for å størkne mediet i dem. Vanndamp som kan kondensere på den indre overflaten av platene og dekslene, blir fordampet ved å holde platene og dekslene i omvendt stilling i en inkubator ved 37 ° C i ca. 1 time.

9. Hver plate er merket på undersiden til fire kvartaler.

10. "Spot-inokulering" av testbakteriene gjøres aseptisk, fortrinnsvis i et laminært strømningskammer, i midten av hvert kvartal ved å lage en flekk (eller et lite smear) av bakteriene ved hjelp av en flamme-sterilisert sløyfe. Sløyfen steriliseres etter hver inokulasjon.

11. De inokulerte platene inkuberes i omvendt stilling, topp ned, ved 37 ° C i 24 til 48 timer i en inkubator til kolonier av bakteriene er synlige.

12. Plattene oversvømmes med oppløsning av 1 N saltsyre (eller 0, 1% toluidinblå).

observasjoner:

1. Transparente klare soner (eller rosa halo) dannet rundt kolonier: DNase positiv.

2. Transparente klare soner (eller rosa halo) ikke dannet rundt kolonier: DNase negativ.