I Dole Test for å finne ut bakteriens evne til å hydrolysere aminosyre tryptofan (med figur)

I Dole Test for å finne ut muligheten for bakterier til å hydrolysere aminosyre tryptofan!

Prinsipp:

Noen bakterier har evnen til å hydrolyse aminosyre tryptofan til indol, da de kan produsere enzymet 'tryptofanase'.

Tryptofan hydrolyseres med produksjonen av indol, pyrodruesyre og ammoniakk. Indol oppdages av fargereagenset, paradimetylaminobenzaldehyd (p-DMAB, dvs. Kovacs reagens), som produserer en rosa ring. Indol reagerer med p-DMAB for å produsere sammensatt 'quinoidal rødviolett forbindelse (rosindol fargestoff)', som er rosa i farge. Ringen produseres ved overflaten, idet reagenset fremstilles i amylalkohol.

I indolprøven dyrkes testbakteriene i et kjøttmedium som inneholder tryptofan. Hvis bakteriene har evne til å hydrolyse tryptofan til indol, dannes en rosa ring ved overflaten av buljongkulturen ved tilsetning av p-DMAB.

Materialer som kreves:

Testrør, konisk kolbe, bomullsplugger, inokuleringssløyfe, autoklaver, bunsenbrenner, laminarflytkammer, disponere krukke, inkubator, tryptonbuljong, Kovacs reagens (paradimetylaminobenzaldehyd), isolerte kolonier eller rene kulturer av bakterier.

Fremgangsmåte:

1. Ingrediensene av tryptonbuljongmedium eller dets ferdige pulver som kreves for 100 ml av buljongen, veies og oppløses i 100 ml destillert vann i en 250 ml konisk kolbe ved risting og virvling. Trypton virker som en kilde til tryptofan. Derfor er tilsetning av tryptofan til buljongen valgfri (figur 7.3).

2. pH-verdien bestemmes ved bruk av pH-papir eller pH-meter og justeres til 7, 5 ved bruk av 0, 1N HC1 hvis det er mer eller ved bruk av 0, 1N NaOH hvis det er mindre. Kolben oppvarmes, hvis nødvendig, for å oppløse ingrediensene helt.

3. Kjøttbøllen er fordelt i fem reagensrør (ca. 5 ml hver), bomullskoblet, dekket med håndflate og festet med tråd eller gummibånd.

4. Brothørene blir sterilisert ved 121 ° C (15 psi trykk) i 15 minutter i en autoklav.

5. Kjøttboksene får avkjøles til romtemperatur.

6. Testbakteriene inokuleres aseptisk, fortrinnsvis i et laminært strømningskammer, inn i buljongen ved hjelp av en inokuleringssløyfe sterilisert over bunsenflammen. Sløyfen steriliseres etter hver inokulasjon.

7. De inokulerte buljongrørene inkuberes ved 37 ° C i 48 timer i en inkubator.

8. Fargereagenset, para-dimetylaminobenzaldehyd (p-DMAB), (dvs. Kovacs reagens) blir droppet i buljongørene (0, 5 ml hver) og observert etter 1 minutt.

Alternativt:

7. Papirstrimler som er fuktet i oksalsyre, settes i munnen av de podede buljongrørene, slik at omtrent halvparten av papirstrimlene forblir inne i rørene uten å berøre buljongen og den andre halvparten forblir til utsiden. For dette blir filterpapir kuttet i striper med en lengde på ca. 35 mm og 5 mm. Stripene er gjennomvåt i varm mettet vandig oppløsning av oksalsyre og tørket før bruk.

8. De inokulerte buljongrørene inkuberes ved 37 ° C i 48 timer i en inkubator.