Essay on Cloning Vectors, Genomic and cDNA Library

Les dette essayet for å lære om Cloning Vectors, Genomic og cDNA Library. Etter å ha lest dette essayet vil du lære om: 1. Betydning av kloningvektor 2. Egenskaper for en kloningsvektor 3. Typer vektorer 4. DNA-bibliotek 5. cDNA-bibliotek.

Innhold:

  1. Essay on the meaning of Cloning Vector
  2. Essay on the Characteristics of a Cloning Vector
  3. Essay on the Types of Vectors
  4. Essay på DNA-biblioteket
  5. Essay på cDNA-biblioteket

Essay # 1. Betydning av kloning vektor:

En kloningsvektor kan også betegnes som et kloningsmedium eller bærer-DNA eller bare som en vektor eller et kjøretøy. Kloningsvektoren er DNA-molekylet i hvilket mål-DNA er introdusert for kloning og som er i stand til replikasjon i vertsorganisme. Disse vektorene kan være plasmider, bakteriofager, kosmider, virus etc.


Essay # 2. Kjennetegn ved en kloningsvektor:

En kloningsvektor må ha noen viktige egenskaper som er som følger:

1. Det må kunne replikere i vertsorganismen etter introduksjonen for å produsere flere kopier av mål-DNA sammen med seg selv.

2. Det skal være lett å være forberedt, dvs. det skal lett isoleres og renses.

3. Det skal være mindre i størrelse for å unngå vanskeligheter under genkloning.

4. Det må inneholde markørgener (som tet r, kan r, etc.) som hjelper til med å velge transformerte celler fra de ikke transformerte.

5. Et unikt spaltningssted må være tilstede for restriksjonsenzymer '.

6. En vektor skal inneholde spesifikt kontrollsystem som promotorer, terminatorer, operatører, etc. slik at det klonede DNA kan uttrykke seg riktig.


Essay # 3. Typer av vektorer:

Det finnes en rekke forskjellige vektorer som kan brukes til å klone det ønskede DNA-fragment i en egnet vert. To brede kategorier av vektormolekyler blir brukt, nemlig plasmider og bakteriofager. Imidlertid er noen andre typer vektorer også blitt utviklet som kosmider, fagmider. plantevirus, etc.

En kort beskrivelse av forskjellige kloningsvektorer er gitt nedenfor:

(1) Plasmidvektorer:

Plasmider er de ekstra kromosomale dobbeltstrengede, lukkede og sirkulære, selvrepliserende DNA-molekylene som finnes i bakteriecellene. Deres størrelse varierer fra 1 kb til mer enn 200 kb. Plasmider kan eksistere enten uavhengig eller kan bli integrert i bakteriekromosomet.

De plasmidene som er integrert i det bakterielle kromosomet kalles som episomer. En rekke vertsegenskaper blir gitt av plasmidene som nitrogenfiksering, antibiotikaresistens, antibiotikaproduksjon, colicin-produksjon, etc.

Noen få mest studerte typer bakterielle plasmider er:

Jeg. R-plasmid: De bærer gener for resistens mot antibiotika.

ii. F-plasmid eller fruktbarhetsfaktor: ansvarlig for konjugering.

iii. Kol-plasmider: Bær gener for kolikiner (proteinet som dreper sensitive E. coli-celler).

iv. Ti-plasmider (tumorfremkallende) og Ri-plasmider (rot-induksjon) fra Agrobacterium spp.

Enkelt kopi og flere kopi plasmider:

Når plasmidene opprettholdes som bare en kopi per bakteriell celle, kalles de som enkeltkopi plasmider. I motsetning herved opprettholdes de multiple kopi- eller multi-kopi plasmider vanligvis som 10-20 kopier per bakteriecelle (figur 1).

Avslappet og strengere replikasjon av plasmider:

Multi-kopim plasmidene replikeres under den avslappede replikasjonskontrollen hvor de gjennomgår mer enn en replikasjon for hver replikasjon av vertsgenomet (fig. 2).

På den annen side er replikasjonskontrollen av enkeltkopi-plasmidene den samme som for vertsgenomet. Det betyr at enkeltkopiplasmiderne gjennomgår bare én replikasjon for hver replikasjon av deres vertsgenomet, og dette kalles den strengre replikasjonskontrollen.

For å være nyttig som en kloningsvektor må plasmidet bære egenskapene til en god vektor som mindre størrelse, markørgener, unike klyvningssteder, og den skal kunne replikere på en avslappet måte.

Når plasmidene blir replikert under avslappet replikasjonskontroll, blir de akkumulert i cellen i meget stort antall kopier, kan være 1000 eksemplarer per celle eller mer. I dette tilfellet blir således utbyttepotensialet økt; Derfor blir slike plasmider (dvs. multi-kopi plasmider) brukt som kloningsvektorer.

Noen plasmider, på grunn av spesifisiteten av replikasjonsstart, kan replikere i bare en art av vertscelle. Andre plasmider har mindre spesifikk opprinnelse av replikasjon og kan replikere i en rekke bakteriearter. Disse plasmidene kalles henholdsvis som smal-vert-område og brede vertsområde-plasmider.

Som autonome, selvrepliserende genetiske elementer har plasmider de grunnleggende egenskapene for å gjøre dem mulige kloningsvektorer. Imidlertid kan de naturlig forekommende plasmidene mangle flere viktige egenskaper som kreves for en høykvalitets kloningsvektor.

Derfor kan man måtte modifisere de naturlige plasmidene ved genteknologi for å oppnå de passende kloningsvektorer som refereres til som modifiserte eller konstruerte plasmidvektorer.

Disse modifikasjonene kan gjøres ved å sette gener til antibiotikaresistens eller for avslappet replikasjon, etc., inn i plasmidet. Et antall slike modifiserte plasmider er blitt oppnådd som gjør underverk som kloningsvektorer.

pBR322:

Det er et omfattende brukt, populært plasmid for molekylær kloning. I navnet heter p det som et plasmid; BR står for navn på forskere F. Bolivar og R. Rodriguez som skapte dette plasmidet, mens 322 er den numeriske betegnelsen gitt til dette plasmidet av dets skapere, den ble konstruert i laboratoriet fra naturlig plasmid slik at den ville ha de ønskelige egenskapene til en kloning vektor.

De nyttige egenskapene til pBR322 inkluderer mindre størrelse (~ 4, 4 kb) og tilstedeværelse av to antibiotikaresistensgener som gir resistens mot ampicillin (ampr) og tetracyklin (tet r ). Et annet fordelaktig trekk ved pBR322 er at den opprettholdes ved et høyt kopiantal i E. coli, men har en opprinnelse av DNA-replikasjon som bare virker i E. coli og derfor ikke lett kan overføres til andre bakterier.

pBR327:

Den er avledet fra pBR322 etter å ha gjort noen få modifikasjoner som fjerning av ~ 1 1 kb segment. I motsetning til pBR322 er det et ikke-konjugativt plasmid, og derfor styrer det ikke sin egen overføring til andre E. coli-celler. Den kan opprettholdes i et høyere antall kopier (45 - 60) pr. E. coli-celle sammenlignet med pBR322.

pUC8:

Denne modifiserte plasmidvektoren har blitt avledet fra pBR322. Den inneholder lac Z-genet og ampicillinresistent genet (amp). En av de største fordelene ved å bruke dette plasmidet som vektor er at rekombinante celler kan identifiseres i en enkelt trinns prosess. Kloningforsøk med pUC8 tar derfor nesten halvparten av tiden sammenlignet med den med PBR322 eller pBR327.

pUC19:

Dette har blitt utviklet fra pBR322. Dens størrelse er ~ 2, 7 kb. Den inneholder et ampicillinresistent gen (amp), lac Z '-gen, med mange unike kloningssteder) og en opprinnelse av replikasjon fra pBR322.

(2) Bakteriofagvektorer:

Bakteriofager er virusene som smitter bakterier. Disse er vanligvis kjent som fag. Bakteriofager angriper bakteriecellene og injiserer genetisk materiale (DNA eller RNA) i dem, som deretter replikeres og uttrykkes inne i bakteriene. To bakteriofager som er blitt modifisert og vanligvis brukes som kloningsvektorer, er Phage-A og Phage-M 13.

Fag lambda (λ) Vector:

Den inneholder ~ 48 kb DNA som er lineær og dobbeltstrenget med enkeltstrengede komplementære ender av 12 nukleotider (som kalles kohesive ender). Fag-λ. genom har et stort ikke-essensielt område som ikke er viktig for cellelyse. I dette λ-genomet kan det fremmede DNA settes inn, eller fag-DNA kan erstattes av det fremmede DNA.

Etter infeksjon kommer dette lineære A-genomet med fremmed DNA inn i bakteriecellen. Innenfor bakteriecellen sirkulerer denne λ-genen ved sammenkobling av kohesive ender. Slike forseglede kohesive ender kalles nå cos-steder (figur 4). Nå kan fagen enten vedta lytisk eller lysogen fase og produsere et antall kopier.

Phage M13 Vector:

Det er en veldig liten fag av E. coli som bare smitter via sexpilus. Dens DNA er sirkulært, enkeltstrenget og er - 10 kb langt. Etter å ha kommet inn i E. coli-cellen, syntetiserer dette enkeltstrengede DNA sin gratis streng og blir dermed dobbeltstrenget, som er en mellomprodukt kjent som replikativ form (RF).

I denne RF vises den opprinnelige strengen som '+' og den nye strengen vises som streng. Bare '+' -strengen pakkes inn i de nye fagbeleggene. Denne RF av fag M13 virker som et plasmid og brukes som vektor for kloning (figur 5).

(3) Kosmidvektorer:

Cosmid er en kloningsvektor som består av kostnadsstedet til fag-X satt inn i et plasmid. Uttrykket cosmid er avledet fra 'cos' og 'plasmid' . Kosmider mangler gener som koder virale proteiner. Disse brukes normalt til kloning av DNA-fragmenter opptil 45 kb i lengde.

Typiske kosmider har følgende egenskaper:

en. En opprinnelse av replikering

b. Unikt restriksjonssete

c. Et markørgen fra plasmid.

d. Et "cos" -sted på ca 12 baser lang.

e. Størrelsen er liten.

Cos-stedet tilstede i kosmid hjelper genomet for sirkulasjon og ligering. Eksempler på kosmidvektorer er c2XB, sCos-serien, etc. (figur 6).

(4) Fagemidvektor:

Et fagemid er beskrevet som en dobbeltstrenget plasmidvektor som inneholder en opprinnelse av replikasjon fra en filamentøs fag, i tillegg til plasmidets. Det kan brukes til å syntetisere en enkeltstrenget versjon av et klonet gen.

Et eksempel på fagemidvektor er pBlueScriptllKS (+/-) (figur 7). Det er en fagemidvektor som er ~ 2960 bp langt derivat av pUC19. Bokstavene KS i navnet representerer at transkripsjonen av lacZ-genet beveger seg fra restriksjonsstedet Kpnl mot Sacl.

Viktige funksjoner som finnes i pBlueScript HKS (+/-) vektoren er:

1. En opprinnelse av replikasjon fra fag f1.

2. En lacl-promotor som komplementerer med lac Z-genet.

3. Flere kloningssteder (MCS) flankert av fag T3- og T7-promotorsekvenser i motsatte retninger på de to strengene.

4. Ampicillin Resistance-gen (ampr) er også tilstede.

5. En opprinnelse av replikasjon ColEl ori fra et plasmid.

(5) Kunstige kromosomvektorer:

Kunstige kromosomer er faktisk den lille og veldefinerte DNA-sekvensen som er konstruert som rekombinant kromosom. Disse kunstige kromosomene kan brukes som vektorer for å transportere svært store klonede fragmenter av DNA.

Ulike typer kunstige kromosomvektorer er:

YAC:

Gjær kunstig kromosom. YAC er en lineær vektor som oppfører seg som gjærekromosom.

En typisk YAC består av:

(a) Et centromerisk element (CEN)

(b) En autonomt replikerende sekvens (ARS), dvs. en replikasjonsstart for gjær.

(c) To telomeriske sekvenser (TEL)

(d) Selekterbare markørgener for gjær.

Et vanlig eksempel på YAC er pYAC3, og organisasjonen er vist i det angitte fig. 8.

BACs brukes som et alternativ til YAC kloning vektor. Disse holdes stabilt i E. coli som en stor enkeltkopi. De er konstruert ved å bruke F-faktor (fertilitetsfaktor) tilstede i E. coli. BAC er egnet for kloning av like store (~ 50 kb eller mer) sekvenser av DNA. Eksempler på BAC vektorer er pBAC108L, pBeloBACl11, etc.

Andre typer kunstige kromosomer er:

MAC: Mammalian Artificial Chromosomes

HAC: Menneskelige kunstige kromosomer.

(6) Plantevirusbasert vektor:

Plantevirus forårsaker infeksjon som resulterer i innføring av gener i vertsceller. DNA-innsatsen koblet med viralt DNA kan også bli levert inn i vertscellene, og således virker plantevirusene også som kloningsvektorer. Noen eksempler på slike plantevirus er caulimovirus, Gemini-virus, tobamovirus etc.

(7) Animalvirusbaserte vektorer:

Det finnes en rekke virus i naturen som forårsaker sykdommer hos dyr. Dyrevirusers evne til å injisere sitt genetiske materiale i vertscelle utnyttes for å designe kloningsvektorer basert på animalsk virus. Eksempler er adenovirus, retrovirus, baculovirus, etc.

(8) Shuttle vektorer:

Disse vektorene er opprettet ved rekombinante teknikker. De har evnen til å replikere i cellene i mer enn én organisme. De kan eksistere både i eukaryotiske og prokaryote celler. De har to replikasjonsformer, en spesifikk for hver vertsorganisme.

Viktige egenskaper til transportvektorer er gitt nedenfor:

en. Det er i stand til replikasjon i mange organismer.

b. Den er liten i størrelse.

c. Valgbare markører er tilstede i den for enkel gjenkjenning av vektor.

d. Det er stabilt.

e. Det er ikke-patogen.

Et viktig eksempel på transportvektorer er YEp (gjærepisomalplasmid) som kan replikere i Ecoli og gjær.

(9) Transposoner eller transponeringselementer kan også brukes som kloningsvektorer.

Uttryksvektor:

Det er en vektor som er utformet på en slik måte at DNA-innsatsen integrert med vektor uttrykkes i vertsorganismen. Enkle kloningsvektorer resulterer kun i inkorporering av det fremmede genet i vertscellen. Men når det gjelder å oppnå produksjonen av rekombinante proteiner kodet av dette fremmede genet, trenger denne kloningsvektoren modifikasjon som gjøres ved å sette inn noen spesielle sekvenser.

En slik modifisert kloningsvektor som er utformet for ekspresjonen av fremmedgen (eller DNA-innsats) i vertscellene kalles ekspresjonsvektor.

Man bør vite at de spesielle sekvensene som brukes for slik modifikasjon, er promotorsekvens (gir signaler for å starte transkripsjonen) og terminatorsekvensen (gir signaler for avslutning av transkripsjonen). I enkle ord er uttryksvektorer de kloningsvektorer som også inneholder signaler for proteinsyntese.


Essay # 4. DNA Library:

Det kan også bli referert til som genbibliotek. Som begrepet "bibliotek" betyr; DNA-bibliotek er samlingen av kloner som bærer forskjellige DNA-sekvenser fra en organisme. Så, et DNA-bibliotek er en blanding av mange DNA-sekvenser som er blitt klonet inn i vektor A. DNA-biblioteket er gunstig for isolering av en eller flere beslægtede gener av en organisme og også for lagring og analyse av forskjellige gener.

På grunnlag av DNA-kilden er DNA-biblioteker av to typer:

(i) genomisk bibliotek

(ii) cDNA-bibliotek.

Genomisk bibliotek:

Det er samlingen av kloner av DNA som er direkte avledet fra genomet av en organisme. Et genomisk bibliotek representerer det fullstendige genom av en organisme.

Trinn for konstruksjon av genomisk bibliotek er (figur 9):

(a) Hele genomisk DNA ekstraheres fra organismen og renses.

(b) Dette rensede DNA brytes da i fragmenter av størrelse som er passende for kloning. Fragmentering av DNA kan gjøres enten ved bruk av restriktionsendonuklease-enzym eller by-fysiske metoder som skjærings- eller ultralydbølger, etc.

(c) Fragmenter blir deretter satt inn i kloningsvektorer for å oppnå rekombinante DNA-molekyler. Hver vektor består av forskjellige fragmenter av DNA.

(d) Denne populasjonen av rec DNA-molekyler overføres deretter til vertscellen for kloning.

(e) En samling av slike fragmenter klonet på denne måten refereres til som et genomisk bibliotek. Det genomiske biblioteket for organismer med større genomer er konstruert med X-fag eller kunstige kromosomvektorer som YAC, BAC, etc. mens plasmidvektorer anvendes for konstruksjon av genomisk bibliotek for organismer som har mindre genomer som bakterier.


Essay # 5. cDNA Library:

cDNA står for komplementært DNA. Et cDNA-bibliotek fremstilles fra mRNAer ved bruk av enzym-revers transkriptase.

Fremgangsmåte for konstruksjon av cDNA-bibliotek er (figur 10):

(a) mRNA er isolert fra det aktive vev som syntetiserer proteiner.

(b) En passende oligonukleotidprimer blir tilsatt til 3'-enden av mRNA.

(c) Omvendt transkriptaseenzym utvider primeren og danner en komplementær DNA-streng.

(d) Som et resultat oppnås en RNA-DNA-hybrid hvorfra RNA'et fjernes ved alkalisk hydrolyse eller ved RNase-enzym.

(e) Nå er det bare en cDNA-streng som syntetiserer sin egen komplementære streng ved å bruke sin 3'-ende som en primer.

(f) En hårpinne sløyfe dannes som fordøyes av et spesifikt enzym som resulterer i dannelsen av en DNA-dupleks.

(g) Et antall slike DNA-duplekser genereres ved bruk av forskjellige mRNA-maler og samles som et cDNA-bibliotek.