Eksperiment til å dyrke og oppsummere en bakteriefag

Eksperiment til å dyrke og oppsummere en bakteriefag!

Prinsipp:

En suspensjon av bakterier, utsatt for bakteriofag (virus som infiserer bakterier), er podet med den bakteriofagen og får vokse som en sammenflytende plen på en agarplate.

Bakteriofagpartiklene vokser i bakteriecellene og lyser dem. Lysis av bakteriecellene resulterer i dannelsen av klare soner i bakterienes sammenhengende plen. Disse klare sonene kalles 'plaques'. Hver klar sone antas å bli dannet av en enkelt bakteriofagpartikkel. Dermed representerer antall plakkdannende enheter (PFU'er) antallet av bakteriofagen.

Seriell fortynningsteknikk brukes i oppregningen av bakteriofager som ligner den som brukes i oppregningen av bakterier. Antallet fagpartikler inneholdt i en prøve bestemmes ved å telle antall plaques dannet på den podede agarplaten og multiplisere dette med fortynningsfaktoren.

For å bestemme en gyldig fagtelling, bør antall plakk per plate ikke overstige 300 eller være mindre enn 30. Plater som viser større enn 300 PFUs, kalles for mange å telle (TNTC), mens plater som viser færre enn 30 PFUs betegnes 'for få til å telle' (TFTC).

Materialer som kreves:

Tryptonbuljong, trypton myk agar, trypton hard agar, konisk kolbe, reagensrør, steriliserte petriskåler, bomullstenger, lagerkultur av bakteriofag (Ex: T ₂ coliphage), næringsbuljongkultur av bakteriene (Ex: Escherichia coli B), steriliserte pipetter, autoklav, varmtvannsbad, bunsenbrenner, laminarflytkammer, kast beholder, inkubator.

Fremgangsmåte:

1. Femten pipetter (i en rustfritt stålpipettveske) og fem petriskål steriliseres i en varmluftsovn ved 180 ° C i 3 timer. Alternativt kan de dekkes med fagpapir, bundet med tråd eller gummibånd og steriliseres i en autoklav sammen med media (figur 8.3).

2. Ingrediensene av tryptonbuljongmedium eller det ferdige pulveret som kreves for 100 ml kjøttkraft, veies og oppløses i 100 ml destillert vann i en 250 ml konisk kolbe ved risting og virvling. PH-verdien er justert til 7, 5 ved bruk av 0, 1 N HCI eller 0, 1 N NaOH etter behov. Kolben oppvarmes, hvis nødvendig, for å oppløse ingrediensene helt.

3. Buljongen distribueres i 10 reagensrør (9 ml hver), bomullsplugg, dekket med håndflate og festet med tråd eller gummibånd.

4. Ingrediensene av trypton-mykt agar-medium eller dets ferdige pulver, som kreves for 100 ml av mediet, veies og oppløses i 100 ml destillert vann i en 250 ml konisk kolbe ved risting og virvling. PH-verdien er justert til 7, 5 ved bruk av 0, 1 N HCI eller 0, 1 N NaOH etter behov. Kolben oppvarmes for å oppløse agaret i mediet helt.

5. Dette flytende medium er fordelt i 5 reagensrør (2 ml hver), bomullskoblet, dekket med håndflate og festet med tråd eller gummibånd.

6. Ingrediensene av trypton hard agar-medium eller dets ferdige pulver som kreves for 100 ml av mediet, veies og oppløses i 100 ml destillert vann i en 250 ml konisk kolbe ved oppvarming etter pH-justering til 7, 5. Kolben er bomullsplugg, dekket med håndflate og festet med tråd eller gummibånd.

7. De 10 tryptonbuljongrørene, de 5 tryptonbløde agarrørene og kolben inneholdende trypton-hard agar-medium steriliseres ved 121 ° C (15 psi trykk) i 15 minutter i en autoklav.

8. Det steriliserte trypton-hårde agarmediet i den koniske kolbe helles i 5 steriliserte petriskåler aseptisk for å få 5 trypton-harde agarplater.

9. En ml av stamkulturen av bakteriofagen (Ex: T2-coliphage) overføres aseptisk, fortrinnsvis i et laminært strømningskammer, til et tryptonbuljongrør (9 ml) under anvendelse av en sterilisert pipette. Dette blir 10 ganger fortynningen (dvs. 10 ^-1 ). Dette er aseptisk fortynnet serielt i de andre ni buljongrørene, for å få en endelig fortynning på 10 ^-10 (figur 8.4).

10. De 5 steriliserte tryptonbløde agarrørene blir tatt og oppvarmet på et vannbad til 100 ° C for å smelte agar. Rørene avkjøles og de smeltede, myke, myke rørene holdes ved 45 ° C.

11. Fra de ovennevnte 10 rørene som inneholder fag i forskjellige konsentrasjoner, velges fem rør (dvs. ^10-5, 10 ^-6, 10 ^-7, ^10-8 og ^10-9 ). Fra disse rørene overføres aseptisk 1 ml hver til de fem tryptonbløde agarrørene ved å bruke separate steriliserte pipetter.

12. To dråper næringsbuljongkultur av bakteriene (Eks: Escherichia coli B) overføres aseptisk, fortrinnsvis i et laminært strømningskammer, til hvert trypton-mykt agarrør inneholdende bakteriofagen ved fem forskjellige konsentrasjoner ( ^10-5 til ^10-9 ).

13. Innholdet i de fem tryptonbløde agarrørene som inneholder bakteriofagen og bakteriene blandes raskt ved å rotere mellom håndflatene.

14. Innholdet helles aseptisk over de fem trypton-harde agarplater merket ^10-5 til ^10-9, hvorved det dannes et dobbeltlagsplaterkulturpreparat. Platen svirles forsiktig og får herdes.

15. Platene inkuberes i omvendt stilling ved 37 ° C i en inkubator.

observasjoner:

1. Alle platene blir observert for plakkdannende enheter (PFUer) som utvikler seg som klare soner på bakterieplenen.

2. Bare de platene som har PFUer mellom 30 og 300, anses for opptelling av fag. Antallet PFU på hver tallerken teller. Plater med større enn 300 PFU er betegnet "for mange til å telle" (TNTC), mens plater som viser færre enn 30 PFU er betegnet "for få til å telle" (TFTC). Slike plater er ikke vurdert.

3. Basert på observasjonene beregnes antall bakteriofager per ml av akselfagkulturen ved å bruke følgende formel.

Antall fag / ml = Antall PFU X-fortynningsfaktor

For eksempel, hvis antall PFUer er 280 i en fortynning på ^10-7, så er antallet fag i lagerkulturen av fag 280 X 10 ⁷ fag / ml (= 2, 80 X 10 ⁹ fag / ml).