Orto-Nitrofenyl Galaktosid Test på Bakterier for å finne deres evne til å hydrolyse Ortho-nitrofenyl-PD-Galactoside

Les denne artikkelen for å lære om utførelsen av Ortho-Nitrophenyl Galactoside Test on Bacteria for å finne deres evne til å hydrolyse Ortho-Nitrophenyl-PD-Galactoside!

Prinsipp:

Noen bakterier har evnen til å gjære laktose. De kalles 'laktose-fermenterende bakterier' eller 'laktosefomentere'.

De andre, som ikke kan gjære laktose, kalles laktose-ikke-fermenterende bakterier 'eller' laktose-non-fomenters '.

Laktose-fermenterende bakterier kan produsere to enzymer, nemlig "permease" og "P-galactosidase", som er involvert i gjæring av laktose. Permease hjelper ved inngangen av laktose til bakteriecellene, mens β-galaktosidase hydrolyserer laktose til glukose og galaktose, er β-galaktosidase et intracellulært inducerbart enzym, hvis produksjon er indusert av nærvær av laktose i bakteriecellens omgivelser.

Mens laktose-fermenterende bakterier kan produsere både permease og β-galaktosidase, kan laktose-ikke-fermenterende bakterier ikke produsere permease, men kan eller ikke produsere β-galaktosidase. ONPG-testen utføres for å finne ut muligheten for laktose-ikke-fermenterende bakterier for å produsere β-galaktosidase.

For dette oppløses cellemembranen til laktose-ikke-fermenterende bakterieceller ved å tilsette toluen for å frigjøre alle de intracellulære enzymer, inkludert P-galaktosidase, hvis foreliggende. Enzymet, β-galaktosidase, hydrolyserer substratet orto-nitrofenyl-P-D-galktosid (ONPG) til orto-nitrofenol, som er gul i fargen.

I orto-nitrofenylgalaktosid-testen (ONPG-testen) dyrkes testbakteriene på tvers av sukkerjernsagar (TSI agar), som inneholder laktose. Hvis bakteriene er en laktose-ikke-fermentert, som angitt med rødt rødt og rødt skrå, blir en tykk suspensjon av bakteriene gjort i saltvann, til hvilken tilsettes toluen etterfulgt av ONPG-oppløsning. Hvis bakteriene har evnen til å produsere enzymet P-galaktosidase, endres fargen på bakteriesuspensjonen til gul.

Materialer som kreves:

Testrør, konisk kolbe, bomullsplugger, inokuleringssløyfe, inokuleringsnål, autoklav, bunsenbrenner, laminarflammekammer, disponere krukke, inkubator, TSI agar, toluen, o-nitrofenyl-P-D-galaktosid (ONPG) løsning, isolerte kolonier eller rene kulturer av bakterier.

Fremgangsmåte:

1. Ingrediensene i TSI agar medium (som inneholder 3 sukkerarter og jern som hovedkomponentene) eller dets ferdige pulver som kreves for 100 ml av mediet, veies og oppløses i 100 ml destillert vann i en 250 ml konisk kolbe ved risting og hvirvling (figur 7.16).

2. pH-verdien bestemmes ved bruk av pH-papir eller pH-meter og justeres til 7, 4 ved bruk av 0, 1N HCI hvis det er mer eller ved bruk av 0, 1N NaOH hvis det er mindre.

3. Kolben oppvarmes for å oppløse agaret i mediet helt.

4. Før det størkner, fordeles mediet i varm smeltet tilstand i 5 reagensrør (ca. 20 ml hver).

5. Testrørene er bomullspluggede, dekket med håndflate og festet med tråd eller gummibånd.

6. De blir sterilisert ved 121 ° C (15 psi trykk) i 15 minutter i en autoklav.

7. Etter sterilisering fjernes de fra autoklaven og holdes i en skrå stilling for å avkjøle og størkne mediet for å få TSI-agar-skråninger.

8. Testbakteriene inokuleres aseptisk, fortrinnsvis i et laminært strømningskammer, inn i skråene ved å stikke inn i rumpen og strekke på overflaten av skråene ved hjelp av en flamme-sterilisert nål. Nålen steriliseres etter hver inokulasjon.

9. De inokulerte skinnene inkuberes ved 37 ° C i 24 timer i en inkubator.

10. Hvis bakterien er en laktose-fermenter, er den ikke valgt for ONPG-test. Hvis bakteriene er laktose-ikke-fermentor, som angitt med rødt rødt og rødt skrå, er det valgt for ONPG-test.

11. Til et testrør som inneholder 0, 25 ml saltvann, settes en tykk kultur av bakteriene ved hjelp av en flamme-sterilisert sløyfe for å gjøre en tykk suspensjon av bakteriene.

12. En dråpe toluen blir tilsatt, blandet og inkubert i 5 minutter ved 37 ° C.

13. O-nitrofenylgalaktosidoppløsning (ONPG-oppløsning) tilsettes og inkuberes ved 37 ° C i 30 minutter. Deretter blir fargeendringen observert. Igjen fargeendring observeres etter 24 timer.