Oksidasetest på bakterier for å finne ut deres evne til å hydrolyse gelatin ved å produsere gelatinase
Oksidase test på bakterier for å finne ut deres evne til å hydrolyse gelatin ved å produsere gelatinase!
Prinsipp:
Noen bakterier har evnen til å hydrolysere gelatin, da de kan produsere proteolytisk enzym 'gelatinase'.
Selv om gelatinet utfelles ved dannelse av kvikksølvkloridproduksjon, blir dets hydrolyserte sluttprodukter ikke utfelt av merkuriklorid, for hvilket de ikke frembringer slik transluksens, frembringer fremdeles åpenhet.
I gelatiniseringsprøven dyrkes testbakteriene på agarplater inneholdende gelatin. Etter at kolonier av bakteriene er synlige, overskrides platene med en oppløsning av kvikksølvklorid. Hvis bakteriene har evne til å hydrolysere gelatin, hydrolyserer koloniene gelatinen i mediet i områdene rundt dem, mens resten av platene i platene beholder uhydrolysert gelatin.
Som et resultat dannes der gjennomsiktige klare soner rundt koloniene når de oversvømmes med en oppløsning av kvikksølvklorid, da de hydrolyserte produktene som dannes rundt dem ikke danner utfellinger med merkurkloridet. På den annen side blir resten av platensarealene gjennomskinnelige, da den uhydrolyserte gelatin i disse områdene danner utfelter med merkurklorid.
Materialer som kreves:
Petri-tallerkener, konisk kolbe, bomullsplugger, inokuleringssløyfe, autoklav, bunsenbrenner, laminarflytkammer, disponere krukke, inkubator, Fraizer's gelatinagar, kvikksølvkloridoppløsning, isolerte kolonier eller rene kulturer av bakterier.
Fremgangsmåte:
1. To petri-tallerkener rengjøres, dekkes med håndflate og festes med tråd eller gummibånd (figur 7.20). Dette trinnet samt steriliseringen av petriskålene i trinn 6 utelates dersom ovnssteriliserte petriskål brukes direkte
2. Ingrediensene i Fraizers gelatinagarmedium (som inneholder gelatin som hovedkomponent) eller dets ferdige pulver som kreves for 100 ml av mediet, veies og oppløses i 100 ml destillert vann i en 250 ml konisk kolbe ved risting og virvling .
3. pH-verdien bestemmes ved bruk av pH-papir eller pH-meter og justeres til 7.2 ved bruk av 0, 1N HCI hvis det er mer eller ved bruk av 0, 1N NaOH hvis det er mindre.
4. Kolben oppvarmes for å oppløse agaret i mediet helt.
5. Kolben er bomullskoblet, dekket med håndflate og festet med tråd eller gummibånd.
6. De to petriskålene og den koniske kolben inneholdende Fraizers gelatinagarmedium steriliseres ved 121 ° C (15 psi trykk) i 15 minutter i en autoklav.
7. Etter sterilisering fjernes de fra autoklaven og får avkjøles i en stund uten at mediet kan størkne. Kjøling av mediet forhindrer kondensering og opphopning av vanndråper inne i platene. Hvis mediet allerede er utarbeidet og størknet under lagring, må det fortynnes ved oppvarming forsiktig til det smelter helt.
8. For å fremstille gelatinagarplater, før den steriliserte Fraziers gelatinagarmedium avkjøles og størkner, i varm smeltet tilstand, helles den aseptisk, fortrinnsvis i et laminært strømningskammer, inn i de to steriliserte petriskålene (ca. 20 ml hver), så at smeltet medium dekker bunnen av petriskålene helt.
Deretter dekkes platen med dekslene og får avkjøles for å størkne mediet i dem. Vanndamp som kan kondensere på den indre overflaten av platene og dekslene, blir fordampet ved å holde platene og dekslene omvendt i en inkubator ved 37 ° C i ca. 1 time.
9. Hver plate er merket på undersiden til fire kvartaler.
10. "Spot-inokulering" av testbakteriene gjøres aseptisk, fortrinnsvis i et laminært strømningskammer, i midten av hvert kvartal ved å lage en flekk (eller et lite smear) av bakteriene ved hjelp av en flamme-sterilisert sløyfe. Sløyfen steriliseres etter hver inokulasjon.
11. De inokulerte platene inkuberes i omvendt stilling, topp ned, ved 37 ° C i 24 til 48 timer i en inkubator til kolonier av bakteriene er synlige.
12. Plattene oversvømmes med oppløsning av kvikksølvklorid (HgCl2).
observasjoner:
Transparente klare soner dannet rundt kolonier av bakterier: Gelatinase positiv.
Transparente klare soner ikke dannet rundt kolonier av bakterier: Gelatinase negativ.
