Oksidasetest på bakterier for å finne ut deres evne til å oksidere redusert cytokrom C

Les denne artikkelen for å lære om oksidasetesten på bakterier for å finne ut deres evne til å oksidere redusert cytokrom C:

Prinsipp:

Noen bakterier har evne til å oksidere 'redusert cytokrom C' tilstede i sine celler til 'oksidert cytokrom C', da de kan produsere enzymet 'cytokromoksidase'.

Den oksyderte cytokrom C produserer lilla farge (Wurster's lilla) med fargestoffet N-tetrametyl-para-fenylendiamin (dvs. oksidasreagens).

I oksidasetesten overskrides næringsagaragar som inneholder koloniene i testbakteriene med løsningen av oksidasereagens. Hvis bakteriene har evnen til å produsere enzymet cytokromoksidase, endres fargen på koloniene på platene til lilla. Hvis bakteriene ikke har evnen til å produsere cytokromoksydase, beholder koloniene den opprinnelige rosa fargen til oksidasereagenset.

Materialer som kreves:

Petri-tallerkener, konisk kolbe, bomullsplugger, platin wire-inokuleringssløyfe, autoklaver, bunsenbrenner, laminar-strømningskammer, disponere krukke, inkubator, Whatman filterpapirstrimmel, oksidasereagens (N-tetrametyl-para-fenylendiamin) nærings agar, isolerte kolonier eller rene kulturer av bakterier.

Fremgangsmåte:

(a) Plate Metode:

1. To petri-tallerkener rengjøres, dekkes med håndflate og festes med tråd eller gummibånd (figur 7.19). Disse trinnene samt steriliseringen av petriskålene i trinn 6 utelates dersom ovnssteriliserte petriskålene benyttes direkte.

2. Ingrediensene av næringsmiddelagarmedium eller dets ferdige pulver som kreves for 100 ml av mediet, veies og oppløses i 100 ml destillert vann i en 250 ml konisk kolbe ved risting og virvling.

3. pH-verdien bestemmes ved bruk av pH-papir eller pH-meter og justeres til 7, 0 ved bruk av 0, 1N HCI hvis det er mer eller ved bruk av 0, 1N NaOH hvis det er mindre.

4. Kolben oppvarmes for å oppløse agaret i mediet helt.

5. Kolben er bomullskoblet, dekket med håndflate og festet med tråd eller gummibånd.

6. De to petriskålene og den koniske kolben som inneholder næringsmiddel agar medium steriliseres ved 121 ° C (15 psi trykk) i 15 minutter i en autoklav.

7. Etter sterilisering fjernes de fra autoklaven og får avkjøles i noen tid, uten at mediet kan størkne. Kjøling av mediet forhindrer kondensering og opphopning av vanndråper inne i platene. Hvis mediet allerede er utarbeidet og størknet under lagring, må det fortynnes ved oppvarming forsiktig til det smelter helt.

8. For å forberede nærings agarplater, før det steriliserte næringsmiddel agarmediet avkjøles og størkner, i varm smeltet tilstand, helles den aseptisk, fortrinnsvis i et laminært strømningskammer, inn i de to steriliserte petriskålene (ca. 20 ml hver), slik at Det smeltede mediet dekker bunnen av petriskålene helt.

Deretter dekkes platen med dekslene og får avkjøles for å størkne mediet i dem. Vanndamp som kan kondensere på den indre overflaten av platene og dekslene, blir fordampet ved å holde platene og dekslene i omvendt stilling i en inkubator ved 37 ° C i ca. 1 time.

9. Hver plate er merket på undersiden til fire kvartaler.

10. "Spot-inokulering" av testbakteriene gjøres aseptisk, fortrinnsvis i et laminært strømningskammer, i midten av hvert kvartal ved å lage en flekk (eller liten smøring) av bakteriene ved hjelp av en flamme-sterilisert sløyfe. Sløyfen steriliseres etter hver inokulasjon.

11. De inokulerte platene inkuberes i omvendt stilling, topp ned, ved 37 ° C i 24 timer i en inkubator til kolonier av bakteriene er synlige.

12. Platen oversvømmes med oksidasereagens.

(b) Papirmetode:

1. En Whatman filterpapirstrimmel, dyppet i 1% oksidasereagens, tørkes og holdes i mørket.

2. Før bruk er det fuktet og en sløyfe av testbakteriene settes på den som en flekk ved hjelp av en platinatrådsløyfe. Nichrome loop kan oksidere reagenset. Derfor må platinsløyfe brukes.

3. Plassen blir observert etter 10 sekunder.