Stivelsehydrolysestest på bakterier for å finne ut deres evne til å hydrolysere stivelse

Stivelsehydrolysestest på bakterier for å finne ut deres evne til å hydrolysere stivelse!

Prinsipp:

Noen bakterier har evnen til å hydrolysere stivelse, da de kan produsere sakkarolytisk enzym.

Mens stivelsen danner mørkblå farge med jod, oppnår de hydrolyserte sluttproduktene ikke slik mørk blå farge med jod.

I stivelsehydrolysetesten vokser testbakteriene på agarplater som inneholder stivelse. Etter at kolonier av bakteriene er synlige, overskrides platene med jodoppløsning. Hvis bakteriene har evne til å hydrolysere stivelse, hydrolyserer koloniene stivelsen i mediet i områdene som omgir dem, mens resten av platene i platene inneholder uhydrolysert stivelse.

Som et resultat dannes der gjennomsiktige klare soner rundt koloniene når de oversvømmes med jodoppløsning, da de hydrolyserte produktene som dannes rundt dem ikke danner mørkblå farge med jod. På den annen side blir resten av platensarealene mørkblå, da jod danner mørkblå farge med den ikke-hydrolyserte stivelsen i disse områdene.

Materialer som kreves:

Petri-tallerkener, konisk kolbe, bomullsplugger, inokuleringssløyfe, autoklaver, bunsenbrenner, laminarflytkammer, kast beholder, inkubator, stivelsesagar, Lugols jodoppløsning, isolerte kolonier eller rene kulturer av bakterier.

Fremgangsmåte:

1. To petriskål blir rengjort, dekket med håndflate og festet med tråd eller gummibånd (figur 7.21). Dette trinnet samt steriliseringen av petriskålene i trinn 6 utelates dersom ovnssteriliserte petriskålene benyttes direkte.

2. Ingrediensene av stivelsesagarmedium (inneholdende stivelse som hovedkomponent) eller dets ferdige pulver som kreves for 100 ml av mediet, veies og oppløses i 100 ml destillert vann i en 250 ml konisk kolbe ved risting og virvling.

3. pH-verdien bestemmes ved bruk av pH-papir eller pH-meter og justeres til 7.2 ved bruk av 0, 1N HCI hvis det er mer eller ved bruk av 0, 1N NaOH hvis det er mindre.

4. Kolben oppvarmes for å oppløse agaret i mediet helt.

5. Kolben er bomullskoblet, dekket med håndflate og festet med tråd eller gummibånd.

6. De to petriskålene og den koniske kolbe inneholdende stivelsesagar-medium blir sterilisert ved 121 ° C (15 psi trykk) i 15 minutter i en autoklav.

7. Etter sterilisering fjernes de fra autoklaven og får avkjøles i noen tid, uten at mediet kan størkne. Kjøling av mediet forhindrer kondensering og opphopning av vanndråper inne i platene. Hvis mediet allerede er utarbeidet og størknet under lagring, må det fortynnes ved oppvarming forsiktig til det smelter helt.

8. For å fremstille stivelsesagarplater, før det steriliserte stivelsesagarmedium avkjøles og størkner i varm smeltet tilstand, helles det aseptisk, fortrinnsvis i et laminært strømningskammer, inn i de to steriliserte petriskålene (ca. 20 ml hver), slik at Det smeltede mediet dekker bunnen av petriskålene helt.

Platen dekkes da av dekslene og får avkjøles for å størkne mediet i dem. Vanndamp som kan kondensere på den indre overflaten av platene og dekslene, blir fordampet ved å holde platene og dekslene i en omvendt stilling i en inkubator ved 37 ° C i ca. 1 time.

9. Hver plate er merket på undersiden til fire kvartaler.

10. "Spot-inokulering" av testbakteriene gjøres aseptisk, fortrinnsvis i et laminært strømningskammer, i midten av hvert kvartal ved å lage en flekk (eller et lite smear) av bakteriene ved hjelp av en flamme-sterilisert sløyfe. Sløyfen steriliseres etter hver inokulasjon.

11. De inokulerte platene inkuberes i omvendt stilling, topp ned, ved 37 ° C i 24 til 48 timer i en inkubator til kolonier av bakteriene er synlige.

12. Platen oversvømmes med Lugols jodoppløsning.