DNA-replikasjon: Mekanismer for DNA-replikasjon

Noen av de viktigste modifikasjonene for DNA-replikasjon er som følger!

DNA-replikasjon i eukaryoter er semikonservativ, semi-diskontinuerlig og toveis sammenlignet med semikonservativ, toveis og kontinuerlig i prokaryoter.

Image Courtesy: dbriers.com/tutorials/wp-content/uploads/2012/12/DNA_replication_split.png

DNA-replikasjon skjer i løpet av S-fasen av cellesyklusen. Det er en flertall kompleks prosess som krever over et dusin enzymer og proteinfaktorer. Det begynner på et bestemt sted som heter replikering eller ori. Bakterielt og viralt DNA har en enkelt opprinnelse av replikasjon. Den fungerer som en enkelt replikerende enhet eller replikon.

I eukaryotisk DNA finnes det en rekke opprinnelsesreplikasjoner. Den har flere replikerende segmenter eller replikoner, dvs. multirepliconic. I fravær av ori, vil replikasjon ikke forekomme. Kravet til en vektor for rekombinant DNA-teknologi er å oppnå replikasjonsstart.

Replikasjon av DNA er energisk svært dyrt. Hoved-enzymet av DNA-replikasjon er DNA-avhengig DNA-polymerase. DNA-replikasjon er ganske rask. Replikeringen av DNA fra E. coli med 4, 6 x 106 bp krever 19 minutter.

På en gjennomsnittlig polymeriseringsgrad av baser er 2000 bp per sekund i hver retning. Replikasjon krever rikelig energi som kommer fra nedbrytning av trifosfater av deoksyribonukleotider.

Replikasjonen foregår som følger:

1. Aktivering av deoksyribonukleotider:

Deoksyribonukleotider eller deoksyribonukleosidmonofosfater forekommer fritt inne i nukleoplasmaet. De er av fire typer deAMP (deoksyadenosinmonofosfat), deGMP (deoksyguanosinmonofosfat), deCMP (deoksycytidinmonofosfat) og deTMP (deoksythymidinmonofosfat). De blir først fosforylert og forandret til aktive former som har tre fosfatrester i stedet for en. Enzymer fosforylase kreves sammen med energi.

De fosforylerte nukleotidene er deATP (deoksyadenosintrifosfat), deGTP (deoksyguanosintrifosfat), deCTP (deoksycytidintrifosfat) og deTTP (deoksytymidintrifosfat). Disse trifosfater av baser tjener to formål. De fungerer som substrat og gir energi til polymerisering av nukleotider.

2. Eksponering av DNA-strenger:

Enzymhelicase (unwindase) virker over Ori-stedet og unzips (deformerer) de to strengene av DNA ved å ødelegge hydrogenbindinger. De separerte strengene stabiliseres ved hjelp av enkeltstrengede bindingsproteiner (SS BPs) eller helixstabiliserende proteiner. Unwinding skaper spenning i den ubundne delen ved å danne flere supercoils. Spenning frigjøres av enzymer topoisomeraser.

De forårsaker nicking og resealing av DNA-strengen. Sammen med topoisomerase har bakterier et annet enzym kalt DNA gyrase som kan introdusere negative supercoils (eldre arbeidere mente at gyrase fungerte både for helikase og topoisomerase).

Ved hjelp av ulike enzymer blir begge DNA-strengene åpne for replikasjon. Men hele DNA åpner ikke i en strekk på grunn av meget høyt energibehov. Separasjonspunktet går langsomt mot begge retningene. I hver retning gir det utseendet til Y-formet struktur som kalles replikasjonsgaffel (Fig. 6.13 og 6.14).

3. RNA Primer:

Det er avgjørende for initiering av nye DNA-kjeder. RNA-primer er en liten RNA-streng som syntetiseres ved 5'-enden av ny DNA-streng ved hjelp av DNA-spesifikt RNA-polymeraseenzym kalt primase. RNA-primer er dannet på den frie enden av en streng og gaffelenden av den andre strengen. Dannelse av RNA-primer utgjør initieringsfasen av DNA-syntese fordi dna-polymeraser ikke kan tilsette nukleotider uten nærvær av RNA-primer.

Et mer komplekst enzym som kalles primo noen er nødvendig i fag ф x 174 og noen andre prokaryote systemer. I eukaryoter utføres primasens funksjon av enzym-DNA-polymerase a. Det bygger opp ~ 10 base RNA og 20-30 baser av DNA (Lewin, 2004). Etter start av nukleotidkjede fjernes RNA-primer og gapet fylles av DNA-polymerase I i prokaryoter og DNA-polymerase P i eukaryoter.

4. DNA-polymeraser:

Prokaryoter har tre hovedtyper av DNA-syntetiserende enzymer kalt DNA-polymeraser III, II og I. Alle legger til nukleotider i 5'-> 3'-retningen på 3'-> 5'-strekning av overordnet streng. De har også 3 '-> 5' ekso-nukleaseaktivitet. Mens DNA-polymerase III hovedsakelig er involvert i DNA-replikasjon (tilsetning og polymerisering av nye baser), er polymerase I et stort reparasjonsenzym. Polymerase II er mindre reparasjonsenzym.

DNA-polymerase I har også 5 -> 3 exonukleaseaktivitet. I eukaryoter finnes fem typer DNA-polymeraser-α, β, γ, δ og ε, men de store tre er a, δ og e. Polymerase 8 er involvert i replikasjon av ledende streng. Polymerase kan bidra til syntese av lagringstreng alongwith andre roller. Polymerase a er størst og viktigste enzym for replikering av DNA. Alle DNA-polymeraser har en konfigurasjon av gripende hånd med tommel på den ene siden, fingrene på den andre og palmen som konkav katalytisk sted for å kombinere mal og basepar.

5. Grunnparing:

De to separerte DNA-strengene i replikasjonsgaffelen fungerer som maler. Deoksyribonukleosidtrifosfater kommer til å ligge motsatt nitrogenbasene av eksponerte DNA-maler - deTTP motsatt A, deCTP motsatt G, deATP motsatt T og deGTP motsatt C.

Nukleofilt angrep separerer et pyrofosfat (PPi) fra trifosfatet. Fosfodiesterbindinger er etablert. Hydrolyse av pyrofosfat ved enzympyrofosfatase frigir energi. Deoksyribouncleosidtrifosfat → Deoksyribouncleosidmonofosfat + PPi

Energien brukes til å etablere hydrogenbindinger mellom de frie nukleotidene og nitrogenbasene av maler.

6. Kjedeformasjon:

Det krever DNA-polymerase III (Kornberg, 1956) i prokaryoter og polymerase 6 / e i eukaryoter. DNA-polymerase III er et komplekst enzym med syv underenheter (a, β, い, ƴ, €, θ, τ). I nærvær av Mg ²⁺, ATP (GTP), TPP og DNA-polymerase III, opprettholder de tilstøtende nukleotidene festet til nitrogenbaser av hver mal-DNA-streng etablering av fosfodiesterbindinger og blir koblet til å danne replikert DNA-streng.

Etter hvert som replikering fortsetter, vil nye områder av foreldre-DNA-dupleks slappe av og skille slik at replikasjonen går raskt fra opprinnelsesstedet til den andre enden. RNA-primeren fjernes og gapet fylles med komplementære nukleotider ved hjelp av DNA-polymerase I. På grunn av sekventiell åpning av DNA-dobbeltkjede og replikering derav for å danne to kjeder, kalles DNA-replikasjon også glidelås-duplisering.

Imidlertid kan DNA-polymerase kun polymerisere nukleotider i 5 '→ 3' retning på 3'-> 5'-streng fordi den legger dem i 3'-enden. Siden de to strengene av DNA løper i antiparallelle retninger, gir de to malene forskjellige endene for replikasjon. Replikasjon over de to maler fortsetter således i motsatte retninger. En streng med polaritet У -> 5 'danner sin komplementære streng kontinuerlig fordi 3'end av sistnevnte er alltid åpen for forlengelse.

Det kalles ledende streng. Replikasjon er diskontinuerlig på den andre malen med polaritet 5 '→ 3 fordi bare et kort segment av DNA-streng kan bygges i 5' → 3 retning på grunn av eksponering av en liten strekning av mal på en gang. Korte segmenter av replikert DNA kalles Okazaki-fragmenter (= Okasaki-segmenter, Reiji Okazaki, 1968). Hver av dem har 1000-2000 bp i prokaryoter og 100-200 bp i eukaryoter.

En RNA-primer er også nødvendig hver gang et nytt Okazaki-fragment skal bygges. Etter å ha erstattet RNA-primer med deoksyribonukleotider og deres polymerisering, blir Okazaki-fragmenter sammenblandet ved hjelp av enzym, DNA-ligase (Khorana, 1967). DNA-streng oppbygget av Okazaki-fragmenter kalles lagringstreng.

Som en streng vokser kontinuerlig mens den andre strengen dannes diskontinuerlig, er DNA-replikasjon semi-diskontinuerlig. Siden replikasjon fortsetter toveis fra opprinnelsen til replikasjon eller ori, vil en overordnet streng danne en ledende streng på den ene siden og lagringstrengen på den andre siden. Det motsatte skjer på foreldrene på den andre siden. Dette hjelper i å fullføre replikasjon samtidig i hele replikonet.

7. Proof-lesing og DNA Reparasjon:

En feil base blir noen ganger introdusert under replikering. Frekvensen er en på ti tusen. DNA-polymerase III er i stand til å fornemme det samme. Den går tilbake, fjerner feil base, gjør det mulig å legge til riktig base og deretter fortsette fremover. Imidlertid kan selv DNA-polymerase III ikke skille uracil fra tymin slik at den ofte innlemmes i stedet for thymin. En slik mismatching korrigeres ved hjelp av en rekke enzymer.

Det er en egen reparasjonsmekanisme for eventuelle skader forårsaket av DNA på grunn av mutasjon, UV-eksponering eller feilpasning som unnslipper korrekturlesingsmekanisme. Et kjeft eller pause skyldes en endonuklease i nærheten av reparasjonsområdet. DNA-polymerase I (Komberg, 1969) fjerner de mismatchede eller forkerte nukleotidene hvis de er til stede og syntetiserer en korrekt erstatning ved bruk av den intakte streng som mal. Det nylig dannede segmentet er forseglet av DNA-ligase.