DNA Replikasjon: Notater om DNA Replikasjon, Reparasjon og Rekombinering

Notater om DNA Replikasjon, Reparasjon og Rekombinasjon!

DNA-replikasjon:

Semi-konservativ DNA-replikasjon:

DNA-replikasjon er en autokatalytisk funksjon av DNA. Det oppstår vanligvis i S-fase av celle syklus når kromosomer er i svært utvidet form. Som foreslått av Watson og Crick, er DNA-replikasjon semi-konservativ.

I den halvkonservative replikasjonen ville de to strengene skille fra hverandre, opprettholde deres integritet og hver vil syntetisere fra nukleotidbassenget, dens komplementære streng. Resultatet ville være at det nylig syntetiserte molekylet ville bære eller bevare en av de to strengene fra foreldremolekylet og den andre strengen ville bli nylig samlet. Det er tilstrekkelige bevis for å bevise at dobbeltstrenget DNA virkelig replikerer ved semi-konservativ metode.

Meselson og Stahls eksperiment (1958):

Disse arbeiderne dyrket Escherichia coli i et medium som inneholdt ¹⁵ N isotoper. Etter at disse hadde replikert i noen generasjoner i det mediet, inneholdt begge strengene av dette DNA ¹⁵ N som bestanddeler av puriner og pyrimidiner. Når disse bakteriene med ¹⁵ N ble overført til et kulturmedium inneholdende ¹⁴ N, ble det funnet at DNA separert fra frisk generering av bakterier besitter en streng tyngre enn den andre.

Den tyngre strengen representerer foreldringsstrengen og lettere en er den nye som syntetiseres fra kulturmediet, og indikerer således semi-konservativ metode for DNA-replikasjon og ekskluderer både konservative og dispersive modeller av DNA-syntese og replikasjon.

Konservativ replikasjon ville ikke produsere noen DNA-molekyler med en "hybrid" konstitusjon. Hvis replikasjon var dispersiv, ville det ha vært et skifte av DNA fra "tungt mot" lys gjennom hver generasjon.

Etterfølgende studier har bekreftet Meselson og Stahls konklusjon om at DNA-replikasjon er semikonservativ og har utvidet den til mange andre organismer, inkludert høyere planter og dyr.

Cairns autoradiografieksperiment:

Han brukte radioaktiv tymin eller tritiert tymidin. Ved å dyrke E. coli i et kulturmedium inneholdende tritiert tymidin, ble radioaktiviteten inkorporert i datter-DNA-molekylene.

I autoradiograf viser dupliserende DNA-molekylet en replikerende gaffel, punktet hvor to kjeder blir fire. Etter første replikasjon ser radioaktiviteten seg inn i bare en av DNA-strengene, og begge strengene er funnet å være merket etter andre replikasjoner. Dette støtter de semi-konservative modi av DNA-replikasjon.

JH Taylors eksperimenter på Viciafaba rotte tips (1957) bekrefter også den semi-konservative metoden for DNA-replikasjon.

Jeg. Diskontinuerlig DNA-replikasjon:

Okazaki foreslo at DNA-syntese fortsetter samtidig på begge DNA-strengene som benytter samme enzym-DNA-polymerase i form av små isolerte fragmenter. Disse segmentene er kjent som Okazaki-stykker og består av 1000-2000 nukleotider. Disse sammenføyes av enzymet polynukleotidligase, som fullfører dannelsen av polynukleotidkjeden.

Den diskontinuerlige syntesen av DNA støttes ved automatisk radiografisk eksperiment.

ii. Enveis og toveis replikering av DNA:

J. Cairns fra sine eksperimenter konkluderte med at DNA-syntese starter ved et fast punkt på kromosomene og fortsetter i en retning, men nyere eksperimenter antyder bidireksjonell replikasjon.

Levinthal og Cairns foreslo at de to strengene ikke skal skille seg helt før replikering under replikasjon. I stedet begynner de å pakke ut i den ene enden, og samtidig begynner de uoppløste segmentene å tiltrekke sine nukleotidpar. På denne måten går unzipping av de originale DNA-strengene og syntese av friske DNA-strenger ut side om side.

DNA-polymerase:

DNA-polymerase er det viktigste enzym av DNA-replikasjon. Dens aktivitet ble først demonstrert av Kornberg i 1956. Den katalyserer det kovalente tilsetning av deoksyribonukleotider til 3'-OH av et tidligere eksisterende nukleotid kalt som primer.

DNA-polymerase-1-enzym anses nå for å være et DNA-reparasjonsenzym i stedet for et replikasjonsenzym. Dette enzymet er kjent for å ha fem aktive steder, nemlig malsted, primersted, 5'-> 3 'spaltnings- eller exonukleassted, nukleosidtrifosfatsted og 3'-> 5'-spaltningssted (eller 3'-> 5'-eksonuklease-sted ).

DNA-polymerase I:

Det er hovedsakelig involvert i å fjerne RNA-primere fra Okazaki eller forløperfragmenter og fylle de resulterende hullene på grunn av dens 5 '-> 3' polymeriseringskapasitet. DNA-polymerase I enzym kan også fjerne tymindimere produsert på grunn av UV-bestråling og fylle gapet på grunn av excision. Dette kalles bevislesning eller redigeringsfunksjon av dette enzymet.

DNA-polymerase-II:

Dette enzymet ligner DNA-polymerase-I i sin aktivitet, men er et DNA-reparasjonsenzym og gir veksten i 5'-> 3'-retningen ved bruk av frie 3'-OH-grupper.

DNA-polymerase-III:

Det spiller en viktig rolle i DNA-replikasjon. Det er et multimer enzym eller holoenzym som har ti underenheter som a, p, e, θ, г, y, δ, δ ', x og Ψ. Alle disse ti subenheter er behov for DNA-replikasjon in vitro; men alle har forskjellige funksjoner. For eksempel har a-underenhet 3 '-> 5' eksonuklease-korrekturlesing eller redigeringsaktivitet. Kjernenzymet omfatter tre underenheter-a, p og θ. Resterende syv underenheter øker prosessiviteten (prosessivitet betyr hurtighet og effektivitet med hvilken en DNA-polymerase utvider voksende kjede).

Eukaryotisk DNA-polymerase:

Eukai yotes (f.eks. Gjær, rotterelever, humane tumorceller) er funnet å inneholde følgende fem typer DNA-polymeraser:

(i) DNA-polymerase a:

Dette enzym med relativt høy molekylvekt kalles også cytoplasmatisk polymerase eller stor polymerase. Det finnes både i kjernen og cytoplasma.

(ii) DNA-polymerase P:

Dette enzymet kalles også nukleær polymerase eller liten polymerase og finnes bare hos vertebrater.

(iii) DNA-polymerase y:

Dette enzymet kalles mitokondriell polymerase og er kodet i kjernen.

(iv) DNA-polymerase 5:

Dette enzymet er funnet i mammale celler og er PCNA avhengig av DNA-syntese prosessivitet (PCNA = proliferating cell nuclear antigen).

(v) DNA-polymerase e:

Det var tidligere kjent som DNA polymerase 5II. Dette enzymet er PCNA-uavhengig og forekommer i pattedyr HeLa-celler og spirende gjær.

Den store DNA-polymerase a er det dominerende DNA-polymeraseenzymet er eukaryote celler og ble antatt å være det eneste enzymet involvert i DNA-replikasjon i lang tid. Men nå er en polymerase, nemlig DNA-polymerase 8, funnet å være involvert i eukaryotisk DNA-replikasjon.

DNA Primers:

Disse enzymene katalyserer syntesen av RNA-primere som er en forutsetning for initiering av DNA-replikasjon i det store flertallet av organismer. Før den faktiske DNA-replikasjon starter, må korte RNA-oligonukleotidsegmenter, kalt RNA-primere eller bare primere, syntetiseres av DNA-primase-enzym ved bruk av ribonukleosidtrifosfater.

Denne RNA-primeren syntetiseres ved å kopiere en bestemt basesekvens fra en DNA-streng og adskiller seg fra et typisk RNA-molekyl ved at etter syntesen forblir primer hydrogenbundet til DNA-malen.

Primrene er ca. 10 nukleotider lange i eukaryoter, og de er laget med intervaller på den laggende streng hvor de er forlenget av DNA-polymerase-enzymet for å begynne hvert okazaki-fragment. Disse RNA-primere blir senere skåret ut og fylt med DNA ved hjelp av DNA-reparasjonssystemet i eukaryoter.

I bakterier er to forskjellige enzymer kjent for å syntetisere primer-RNA-oligonukleotider - RNA-polymerase (på ledestrengen) og DNA-primase (på lagringstrengen).

Polynukleotidligase:

Dette enzymet er et viktig enzym både i DNA-replikasjon og i DNA-reparasjon. DNA-ligase katalyserer dannelsen av fosfodiesterbinding mellom 5'-fosforylgruppen av ett nukleotid og 3-OH-gruppen av den nærmeste nabo ved siden av et nikk i en DNA-streng; dermed tetter det nicks i en DNA-streng.

endonukleaser:

Endonukleaser, spesielt restriktionsendonukleaser, er også viktige under DNA-replikasjon, så vel som DNA-reparasjon. Under DNA-replikasjon kan en endoclease produsere et knippe i opprinnelsen for å initiere replikasjon, eller det kan forårsake nicks å generere en svivel for å lette DNA-avvikling.

Enzymer involvert i åpning av DNA Helix:

DNA helikaser:

DNA-helikaser er ATP-avhengige avviklingsenzymer som fremmer separasjon av de to foreldringsstrenger og etablerer replikasjonsgaffler som gradvis vil bevege seg bort fra opprinnelsen. Oppløsningen av templat-DNA-helixen ved en replikasjonsgaffel kan i prinsippet katalyseres av to DNA-helikaser, som virker i konsert, en som løper langs ledende streng og den andre langs slakkstrengen.

Helix-destabiliserende streng (også kalt single-strand-DNA-bindende proteiner eller SSBPer):

Bak replikasjonsgaffelen hindres de enkelte DNA-strengene fra å spoles om hverandre (eller danner dobbeltstrengede hårpinne-sløyfer i hver enkelt streng) ved virkningen av SSB-proteiner. SSB-proteiner binder til eksponerte DNA-tråder uten å dekke basene, som derfor forblir tilgjengelige for templeringsprosessen.

Topoisomeraser (DNA gyraser):

Virkningen av en helikase introduserer en positiv supercoil i dupleks DNA foran replikasjonsgaffelen. Enzymer, kalt topoisomeraser, slapper av supercoilen ved å feste til den transient supercoil duplex, nicking en av strengene og roterer den gjennom den ubrukte strengen. Nålen blir deretter forseglet.

En type topoisomerase (dvs. topoisomerase I) forårsaker en enkeltstrengspaus eller en nick som tillater de to seksjonene av DNA-helix på hver side av nick for å rotere fritt i forhold til hverandre ved bruk av fosfodiesterbindingen i strengen motsatt nikket som et svingpunkt. En annen type topoisomerase (dvs. topoisomerase II) danner en kovalent binding til begge strengene av DNA-helix samtidig som det gjør transient dobbeltstrengspaus i helixen.

Replicon:

Et replikon er DNA-enheten der individuelle replikasjonsreaksjoner finner sted, det vil si at den er i stand til DNA-replikasjon uavhengig av andre segmenter av DNA. Derfor har hver replikon en opprinnelse der replikering er initiert og det kan ha en terminus der replikasjonen stopper.

De bakterielle og virale kromosomer inneholder vanligvis et enkelt replikon / kromosom. Selv om fag T har to opprinnelser, en primær og en sekundær, men i nærvær av primær opprinnelse er sekundær opprinnelse som regel ikke-funksjonell. I E. coli er opprinnelsespunktet identifisert som genetisk locus oriC.

En komplett prokaryot opprinnelse støtter følgende tre funksjoner: (1) initiering av replikasjon, (2) kontroll av frekvensen av initieringshendelser og (3) segregeringen av de replikerte kromosomer i dattercellene.

Origins har blitt identifisert i bakterier, gjær, kloroplaster og mitokondrier; deres signifikante generelle funksjon er at de er A: T rike som kan være viktige for å lette avviklingen under replikering. Den bakterielle opprinnelsen inneholder mange forskjellige korte (<10 bp) sider som trengs for funksjonen; Disse områdene er noen ganger skilt av bestemte avstander, men ikke av bestemte sekvenser. Disse spesifikt lokaliserte stedene er nødvendige for binding av forskjellige proteiner involvert i DNA-replikasjon.

Flere prokaryotiske replikoner har spesifikke steder, kalt terminus, som stopper replikasjonsgaffelbevegelsen og dermed avslutter DNA-replikasjon. E. coli kromosom har to terminii, kalt T ₁ og T ₂ ligger omtrent 100 Kb på hver side av punktet hvor replikasjonsgaflene skulle møtes. Hver ende er spesifikk for en retning av gaffelbevegelsen.

T1 og T2 er anordnet på en slik måte at hver gaffel må passere den andre for å nå den spesifikke terminalen. Replikasjonstermineringen krever produktet av tus-gen, som sannsynligvis koder for et protein som gjenkjenner T og T2.

I eukaryoter har hvert kromosom flere replikoner (f.eks. Gjær, 500; Drosophila, 3.500; mus 25.000; Viciafaba, 35.000). På et hvilket som helst punkt i S-fase gjennomgår bare noen av disse replikonene replikasjon; hver replikon synes å være aktivert på et bestemt tidspunkt i en bestemt sekvens. Lengden på et eukaryotisk replikon kan variere fra 40 Kb i gjær og Drosophila til ca. 300 Kb i Vicia.

Antallet påvisbare replikoner synes å variere med utviklingsstadiet og cellen eller vevstypen. Dette forklares på grunnlag av vevsspesifikk opprinnelse, slik at noen opprinnelser er aktive i enkelte vev, mens andre er aktive i noen andre vev.

Dette eksemplifiseres av Drosophila hvor de tidlige embryonale celler har 10 ganger så mange replikoner som de i de voksne somatiske cellene. Det tilgjengelige beviset antyder at eukaryotiske replikoner ikke har terminii.

Reproduksjonens trofasthet:

Feilfrekvensen for DNA-replikasjon er mye lavere enn for transkripsjon på grunn av behovet for å bevare betydningen av den genetiske meldingen fra en generasjon til den neste. For eksempel er den spontane mutasjonshastigheten i E. coli ca. en feil pr. 10 ¹⁰ baser inkorporert under replikasjon.

Dette skyldes primært tilstedeværelsen av de mindre tautomere former av basene som har forandret baseparingsegenskaper. Feilsatsen er minimert av en rekke mekanismer. DNA-polymeraser vil bare innlemme et innkommende nukleotid dersom det danner det korrekte baseparet med mal-nukleotidet i dets aktive sted.

Den sporadiske feilen detekteres av 3 '-> 5' korrekturlesingsexonukleasen assosiert med polymerasen. Dette fjerner det ukorrekte nukleotidet fra 3'-enden før ytterligere inkorporering, slik at polymerasen deretter setter inn den korrekte base. For at korrekturlesingsexonukleasen skal fungere ordentlig, må den kunne skille et korrekt basepar fra en feilaktig.

Den økte mobiliteten til "unanchored" basepar i selve 5'-enden av nyopprettede DNA-fragmenters sløvstreng fragmenter, betyr at de aldri kan vises korrekt og så ikke kan korrekturleses. De første nukleotidene er følgelig ribonukleotider (RNA) slik at de senere kan identifiseres som lavt troverdighetsmateriale og erstattes med DNA-forlenget (og korrekturleset) fra det tilstøtende fragmentet. Feil som unnslipper korrekturlesing korrigeres av en feilparametere.

Mekanisme for DNA-replikering i prokaryoter:

In vitro DNA-replikasjon er grundig studert i E. coli og i fager og plasmider av E. coli. I E. coli involverer prosessen med DNA-replikering følgende tre hovedtrinn:

1. Initiering av DNA-replikasjon:

Denne prosessen omfatter tre trinn: (i) gjenkjenning av opprinnelsen (O), (ii) åpning av DNA-dupleks for å generere en region av enkeltstrenget DNA, og (iii) opptak av DNA-B-protein (dvs. 5'3'-helikase ; fungerer også som aktivator av primase). Dermed bindes ATP-komplekset av Dna-A (eller initiatorprotein) ved 9 bp inverterte repeteringsregioner (R,, R,, R _v R ₄ ) av ori C av E. coli og fremmer åpning av DNA-duplekset i et område på tre direkte gjentakelser av 13-bp sekvens (kalt 13-mer).

Åpningen skjer fra høyre 13-mer til venstre og krever negativt supercoiled DNA- og HU- eller IHF-initiatorproteiner. Dna B (-helicase) overføres til eksponert enkeltstrenget DNA og forårsaker avvikling av DNA i nærvær av A TP, SSB protein og DNA gyrase (en topoisomerase).

Dette resulterer i avvikling av DNA-dupleks og replikasjonen fra ori C fortsetter i begge retninger (toveis); SSB-binding skjer på enkeltstrengede områder og to Dna B-komplekser (= primosomer) lastes på hver streng.

2. Forlengelse av DNA-kjeden:

Dette trinnet krever tilstedeværelse av følgende enzymer og faktorer: 1. Dna B eller helikase (også kalt mobilpromotor); 2. primase (Dna G); 3. DNA-polymerase holoenzym (eller DNA pol III HE); 4. SSB protein; 5. RNAase H som fjerner RNA primere; 6. DNA-polymerase I som brukes til å fylle gapet opprettet på grunn av RNA-primere og 7. DNA-ligase (som omdanner primerfrie okazaki-fragmenter til kontinuerlig streng). Under initiering til forlengelsesovergang forekommer følgende hendelser:

(i) Når helikase (eller Dna B) beveger seg i 5'-> 3 'retning, genererer den en replikasjonsgaffel ved å åpne DNA-dupleksen.

(ii) DNA-strengen som har helikase blir den lagrende streng. DNA-primase associerer med Dna B-helikase, danner primosomet som syntetiserer flere primere for lagringstreng og enkelt RNA-primer for den ledende streng.

(iii) For syntese av lagringstreng må DNA-pol III HE arbeide på samme streng som Dna B-helikase er bundet til, men den beveger seg i motsatt retning.

(iii) DnaB helikase, Dna Gprimase og DNA pol III FIE arbeider sammen i strengforlengelse. Helikase- og DNA-polymeraseenheten forblir prosessiv, dvs. de forblir tett bundet til gaffelen og forblir bundet gjennom reaksjonen.

Syntese (- forlengelse) av lagrende og ledende tråder finner sted med noe forskjellige metoder; det er langt mer komplisert for lagging streng enn for ledende streng:

(A) Diskontinuerlig syntese på lagringstreng:

1. Primase tas opp fra oppløsning og aktiveres ved hjelp av helikase (DnaB) for å syntetisere aRNA primer (10 til 20 nt eller nukleotider lang) på lagringstrengen.

2. RNA-primrene er gjenkjent av DNA-pol IIIHU på lagringsstrengen og benyttes for syntese av forløper- eller okazaki-fragmenter. Faktisk gjenkjennes hver ny RNA-primer av gamma (y) underenheten av DNA-pol IIIH og lastet med p-underenhet av den samme polymerase. Denne forhåndsbelastede p-underenheten kan da fange kjernen av DNA poly III HE når den blir tilgjengelig etter å ha fullført sin syntetiske jobb på det foregående okazaki-fragmentet.

3. Etter fullføring av okazakafragmentene blir RNA-primrene utskåret av DNA-polymerase 1, som deretter fyller de resulterende hull med DNA.

4. Etter DNA-polymerase legger jeg til de endelige deoksyribonukleotidene i gapet som er igjen av den utskårne primeren, og enzymet DNA-ligasen fonnerer fosfodiesterbindingen som forbinder den frie 3'-enden av primerutskiftningen til 5'-enden av okazaki-fragmentet.

(B) Kontinuerlig syntese på ledende streng:

1. I toveis DNA-replikasjon, blir den ledende strengen primet en gang på hver av foreldresnorene.

2. RNA-primeren til den ledende streng syntetiseres av RNA-polymeraseenzym.

3. DNA pol III HE forårsaker forlengelse av ledende streng og til slutt DNA-pol 1 og ligase-enzymer gir endelig berøring til ledende streng som i tilfelle av lagringstrengen.

DNA-replikasjon i eukaryoter :

Eukaryotisk DNA-replikasjon krever to forskjellige DNA-polymeraseenzymer, nemlig DNA-polymerase a og DNA-polymerase 5. DNA-polymerase 6 syntetiserer DNA på ledende streng (kontinuerlig DNA-syntese), mens DNA-polymerase a syntetiserer DNA-en på den laggende streng (diskontinuerlig DNA-syntese). Foruten disse to enzymer, DNA replikasjon: (1) T antigen; (2) replikasjonsfaktor A eller RF-A (også kalt RP-A eller eukaryotisk SSB); (3) topoisomerase I; (4) topoisomerase II; (5) proliferating-cell nuclear antigen (PCNA, også kalt cyclin), og (6) replikasjonsfaktor Cor RF-C.

Prosessen med eukaryotisk DNA-replikasjon innebærer følgende trinn:

1. Før inntreden av DNA-syntese er det et presyntetisk stadium på 8-10 minutter for dannelsen av ubunnet DNA-kompleks. Dette trinnet trenger bare tre rensede proteiner, nemlig T-antigen (T-ag eller tumor antigen), RF-A og topiosomeraser I og II.

2. T-antigenet, ved bruk av dets DNA-bindende domene, danner et multi-underenhetskompleks med sted I og sted II i nærvær av A TP og forårsaket lokal avvikling.

3. Mer omfattende tosidig avvikling oppstår på grunn av assosiasjon av RF-A og en topoisomerase med - hjelpen av DNA-helikase-komponent av T-siden Topoisomeraser hjelper til med avvikling av DNA ved å endre DNA-topologi ved replikasjonsgaffelen.

4. RF-A- eller SSB-proteiner binder til å vikle enkeltstrenget DNA.

5. Primer-RNA-syntesen utføres av primase som er tett forbundet med DNA-polymerase ex.

6. DNA-polymerase a hjelper i syntese av et okazaki-fragment i 5'-til-3'-retningen.

7. Replikasjonsfaktor C (eller RF-C) og PCNA (syklin) hjelper i bytte av DNA-polymeraser slik at pol a erstattes av pol 5 som deretter kontinuerlig syntetiseres DNA på ledende streng.

8. Et annet okazaki-fragment syntetiseres deretter fra replikasjonsgaffelen på den laggende streng av pol a-primaskomplekset, og dette trinnet gjentas igjen og igjen til hele DNA-molekylet er dekket.

9. RNA-primrene fjernes og gapene fylles som ved prokaryotisk DNA-replikasjon.

Nylig har DNA-polymerase e-rolle i DNA-replikasjon blitt vektlagt, slik at tre DNA-polymeraser (a, 5 og e) nå er kjent for å være involvert i eukaryotisk DNA-replikasjon. A. Sugino og kollegaer har foreslått at DNA-polymerase a kan fungere ved både de ledende og bøyende tråder (siden polymerase a har a-primaseaktivitet), mens polymerase e og polymerase 5 er involvert i forlengelse av henholdsvis de ledende og binde-strengene.

DNA skade og reparasjon mekanisme

Typer DNA-skade:

1. DNA-lesjoner:

En endring i DNAs normale kjemiske eller fysiske struktur er som kalt DNA-lesjoner. Mange eksogene stoffer, som kjemikalier og stråling, kan forårsake endringer i nitrogen- og karbonatomer i de heterocykliske ringsystemene i basene og noen av de eksocykliske funksjonelle gruppene (dvs. keto- og aminogruppene i basene).

Dette kan føre til tap av baseparering eller endret baseparering (f.eks. En endret A kan baseparre med C i stedet for T). Hvis en slik lesjon får lov til å forbli i DNA, kan en mutasjon bli fikset i DNA ved direkte eller indirekte mutagenese.

Alternativt kan den kjemiske endringen gi en fysisk forvrengning i DNA som blokkerer replikasjon og / eller transkripsjon, forårsaker celledød. Dermed kan DNA-lesjoner være mutagene og / eller dødelige. Noen lesjoner er spontane og forekommer på grunn av DNA's inneboende kjemiske reaktivitet og tilstedeværelsen av normale, reaktive kjemiske arter i cellen.

For eksempel gjennomgår basiscytosinet spontan hydrolytisk deaminering for å gi uracil. Hvis den ikke ble igjen, ville den resulterende uracil danne et basepar med adenin under etterfølgende replikasjon, noe som gir opphav til en punktmutasjon. Depurinering er en annen spontan hydrolytisk reaksjon som involverer spaltning av N-glykosylbindingen mellom N-9 i purinbasisene A og G og C-1 'i deoksyribosesukker og dermed tap av purinbaser fra DNA'et. Sukkerfosfat-ryggraden i DNA forblir intakt. Det resulterende apuriniske stedet er en ikke-kodende lesjon, da informasjon kodet i purinbaser går tapt.

2. Oksidasjonsskader:

Dette skjer under normale forhold på grunn av tilstedeværelsen av reaktive oksygenarter (ROS) i alle aerobe celler, for eksempel superoksid, hydrogenperoksid og, viktigst, hydroksylradikalet (OH). Denne radikale kan angripe DNA, jeg på flere punkter, produserer en rekke oksidasjonsprodukter med endrede II egenskaper, for eksempel 8-oxoguanin, 2-oksoadenin og 5-formyluracil. Nivåene av disse kan økes ved hydroksylradikaler fra radiolysen av vann forårsaket av ioniserende stråling.

3. Alkylering:

Alkyleringsmidler er elektrofile kjemikalier som lett tilsetter alkyl (f.eks. Metyl) grupper til forskjellige stillinger på nukleinsyrer forskjellig fra de som er metylert ved normale metylerings-enzymer. Vanlige eksempler er metylmetansulfonat (MMS) og etylnitrosourea (ENU).

Typiske eksempler på metylerte baser er 7-metylguanin, 3-metyl-adenin, 3-metylguanin og 0-6-metylguanin. Noen av disse lesjonene er potensielt dødelige da de kan forstyrre avviklingen av DNA under replikasjon og transkripsjon. De fleste er også indirekte mutagene; 0-metylguanin er imidlertid en direkte mutagen lesjon som den kan basere med tymin under replikasjon.

4. Bulky addukter:

Cyclobutanpyrimidin dimerer dannes ved ultraviolett lys fra tilstøtende pyrimidiner på en streng ved syklisering av de dobbeltbundne C5- og C6-karbonatomer i hver base for å gi en cyklobutanring. Det resulterende tapet av baseparering med den motsatte streng forårsaker lokalisert denaturering av DNA'et som produserer en voluminøs lesjon som vil forstyrre replikasjon og transkripsjon. En annen type pyrimidindimer, den 6, 4-fotoprodukt, resulterer fra dannelsen av en binding mellom C6 av en pyrimidinbase og C4 i den tilstøtende base.

Når kulltæren kreftfremkallende benzo [a] pyren metaboliseres av cytokrom P-450 i leveren, kan en av dets metabolitter (et diol epoksid) kovalent feste til 2-aminogruppen av guaninrester. Mange andre aromatiske aryleringsmidler danner kovalente addukter med DNA. Leverkarsinogenet aflatoksin B binder også kovalent til DNA.

DNA Reparasjon:

Reparasjonssystemene gjenkjenner en rekke forandringer i DNA for å initiere tiltak. En celle kan ha flere systemer for å håndtere DNA-skade. Disse systemene omfatter følgende: (1) Direkte reparasjon, (2) Ekstern reparasjon (3) Reparasjon av feil, (4) Tolerante systemer og (5) Retrieval systemer.

1. Direkte reparasjon:

Omvendelsen eller enkel fjerning av skadene på DNA er kjent som direkte reparasjon, f.eks. Fjerning av de kovalente bindingene mellom de to 4 og to 5 karbonene i de to tyminrester som deltar i dannelsen av tymindimere.

Tymdimere dannes vanligvis på grunn av UV-bestråling og forstyrrer replikasjon og transkripsjon. Kelner (1949) observerte at mange bakterier kunne overleve store doser av UV-stråling; hvis de ble utsatt for en intens kilde til synlig lys.

Dette fenomenet kalles fotoreaktivering. Det ble senere vist at under UV-bestråling er et bestemt enzym selektivt bundet til det bakterielle DNA. Under fotoreaktiveringsprosessen aktiveres enzymet av det synlige lyset. Det klipper de tymin-dimerer, og gjenoppretter dem dermed til sin opprinnelige form. Denne reparasjonsprosessen er enzymmediert og lysavhengig.

2. Eksklusiv reparasjon:

I denne reparasjonsmekanismen blir det ødelagte eller forandrede segmentet av DNA-strengen utskåret og en ny patch av DNA syntetiseres i sin plass. Selv om excision reparasjonssystemer varierer i deres spesifisitet, omfatter hovedbanen følgende tre trinn:

(i) Anerkjennelse og innsnitt:

Den skadede / endrede delen av en DNA-streng er gjenkjent av en endonuklease; dette enzymet kutter deretter den berørte strengen på begge sider av skaden.

(ii) Eksklusjon:

En 5 '-> 3' exonuklease (DNA-polymerase I) fordøyer den skadede / forandrede delen; Dette genererer en enkeltstrenget region i DNA-dobbelthelixen.

(iii) Syntese:

I dette trinnet tjener den enkeltstrengede regionen produsert ved excisjon som en mal for en DNA-polymerase som syntetiserer erstatning for det utskårne segmentet. DNA ligase forsegler så kallen som gjenstår etter syntesen av erstatning for den utskårne delen.

I E. coli er excisionen sannsynligvis på grunn av 3 '-> 5' exonukleaseaktiviteten til DNA-polymerase I, mens syntese oppnås ved 5'-> 3 'polymeraseaktiviteten av det samme enzym. Excision reparasjonssystemer er ganske vanlig både i prokaryoter og eukaryoter. Noen av disse systemene gjenkjenner generell skade på DNA, mens andre er svært spesifikke, for eksempel, AP-endonukleaser fjerner riboseresidene fra depurasjonsstedene. Excision reparasjon innebærer forskjellige lengder av DNA og er gruppert i følgende tre klasser:

(a) Meget kort oppdatering (VSP):

Dette systemet omhandler reparasjon av feilstillinger mellom bestemte baser.

(b) Kort patch-reparasjon:

I dette systemet blir ca. 20 baser lang DNA-streng utskåret, og skadene repareres gjennom uvr-gener (uvr, A, B, C, E.coli), som koder for komponenter av en reparasjonsendonuklease. Et annet enzym uvr D er også nødvendig for helikaseaktivitet.

(c) Long patch repair:

Dette systemet involverer utskjæring av ca. 1500 baser lange segmenter, men noen ganger kan det ekskluderte segmentet være> 9000 baser. Det er mye mindre vanlig og må induseres av skade som blokkerer replikering. I E. coli involverer dette systemet også uvr-gener og DNA-polymerase I.

3. Feilsøking:

Det innebærer korrigering av uoverensstemmelser eller sammenkobling mellom baser som ikke er komplementære. Ulemper kan oppstå enten (a) under replikering eller (b) på grunn av grunnendringer (f.eks. Deaminering av cytosin til uracil) og resulterer i strukturelle forvrengninger i DNA-dobbelt helixen. Disse alternasjonene håndteres i E. coli ved hjelp av det meget korte patch-eksplisjonsreparasjonssystemet som er beskrevet nedenfor.

Mismatch Repair System i E. coli:

Når det er en feilstilling i et basepar som i GC -> GT, kan det teoretisk sett repareres for å gi opphav til enten villtype (GC) eller til en mutanttype (AT). Derfor må reparasjonssystemet skille mellom gamle og nye tråder og reparere bare den nye strengen for å gjenopprette den ville typen.

Dette gjøres ved hjelp av meget kortpatchekreisjonsreparasjonssystem og krever fire proteiner, nemlig Mut L, Mut S, Mut U og Mut H kodet i E. coli henholdsvis av gener mut L, mut S, mut U og mut H. De feilaktige feilene produsert under replikering korrigeres ved dampresere.

Gen-dammen fra E. coli produserer en metylase som metylerer adenin av sekvens GATC på begge DNA-strengene. Replikeringen av en fullstendig metylert GATC-sekvens gir en hemimetylert sekvens der A-residiene i de nylig syntetiserte strengene er ikke-metylerte.

Den ikke-metylerte tilstanden til denne målsekvensen blir brukt til å identifisere den nye strengen; basene rundt stedet for mismatch i den nye strengen blir skåret ut og en erstatning syntetiseres. Systemet involverer produktene av gener mut L, mut S, mut H og uvr D.

Retrieval Systems Repairs:

Disse systemene er også kjent som "reparasjon etter replikering" eller "rekombinationsreparasjon". I E.coli er dette reparasjonssystemet basert på rec A-genet som produserer Rec A-proteinet. Rec Et proteinfunksjon i utveksling av tråder mellom DNA-molekyler under genetisk rekombinasjon og også funksjoner i singelstrengsutvekslingen under rekombinasjonsreparasjon. Det synes å være to rec A-veier, en som involverer rec B, C-gener og den andre involverer rec F.

Dette reparasjonssystemet virker når en strukturell forvrengning blokkerer replikasjon på det skadede stedet. For eksempel vil E. coli-mutanter mangelfull i eksaksjonsreparasjon ikke kunne fjerne tymin dimerer. I en slik situasjon fortsetter replikasjonen normalt opp til de skadede stedene; DNA-polymerasen stopper replikasjonen av den berørte strengen og gjenoppretter replikasjon som hopper forbi det skadede området.

Komplementærstrengen repliseres normalt på det skadede stedet i den andre strengen. Derfor gir replikasjon en normal avkom fra DNA-molekylet og et molekyl som har tymin dimeren i en streng og et langt gap i sin komplementære streng. Avkom DNA-molekylet med tymin dimer ville gå tapt, med mindre det er reparert ved å fylle gapet i en av dens tråder.

Dette oppnås ved hjelp av enkelstrengsutveksling mellom de to avkom DNA-molekylene; Utvekslingsområdet fyller gapet og er indusert av Rec A protein. Som et resultat av denne utvekslingen har det normale avkomsmolekylet en enkeltstrenget region som har et gap. Dette gapet repareres ved DNA-syntese.

Toleranse System:

Disse systemene håndterer skadene som blokkerer normal replikering på det skadede stedet, muligens ved å tillate replikering av de skadede områdene med en høy frekvens av feil. Disse systemene kan være spesielt viktige i eukaryotene hvor genomstørrelsen er meget stor og derfor er en fullstendig reparasjon av skaden ganske usannsynlig.