Målet er å isolere forskjellige bakterier som finnes i en gitt prøve og opprettholde deres rene kulturer

Målet er å isolere forskjellige bakterier tilstede i en gitt prøve og opprettholde sine rene kulturer.

Hensikt:

Bakterier som finnes i naturen, forekommer ikke som segregerte arter, men de opptrer som blandede populasjoner av forskjellige arter.

Derfor, for å studere de enkelte bakteriearter, er det først nødvendig å separere dem fra den blandede befolkningen. Denne prosessen kalles isolering av bakterier.

Det oppnås ved å vokse den blandede populasjonen av bakterier på overflaten av et fast medium til diskrete kolonier. 'Kolonier' er individuelle, makroskopisk synlige masser av bakterier dyrket på overflaten av fast medium, som hver representerer multiplikasjonen av en enkelt bakterie.

Som hver koloni kommer fra veksten og gjentatt multiplikasjon av en enkelt bakterie, tilhører alle bakteriene tilstede i kolonien til samme art. Dermed representerer hver koloni en meget stor populasjon av en enkelt bakterieart.

Disse koloniene overføres aseptisk til å separere næringsmiddel agar skråninger og får lov til å vokse der. De isolerte bakterieartene, som vokser separat på agar-skråninger, kalles 'rene kulturer'. I hver 15 til 30 dag blir de overført til friske skråninger, slik at de ikke mister sine opprinnelige egenskaper på grunn av overfylling, mangel på næringsstoffer og opphopning av metabolitter.

På denne måten opprettholdes rene kulturer av bakterier i laboratoriet ved gjentatt overføring til friske skråninger med jevne mellomrom. Denne prosessen er kjent som "vedlikehold av ren kultur". Rene kulturer opprettholdes i laboratoriet for deres påfølgende identifikasjon ved forskjellige farger, biokjemiske, serologiske og molekylære teknikker samt for deres fremtidige bruk.

'Kulturer' er standard rene kulturer, hvis identifikasjon har blitt etablert internasjonalt på slekts-, art-, underarter, type eller undertype. De opprettholdes i internasjonalt anerkjente mikrobiologiske laboratorier.

Andre laboratorier kan skaffe dem fra disse laboratoriene og opprettholde i sine egne laboratorier som lagerkulturer, ved gjentatte overføringer til friske skråninger med jevne mellomrom. De brukes til bekreftet identifikasjon av rene kulturer oppnådd i disse laboratoriene ved sammenligning av deres karakteristika med standardkulturer.

Prinsipp:

Den blandede populasjonen av bakterier som er tilstede i et gitt materiale (fast, væske eller overflate) dyrkes på næringsagarplater ved hjelp av spredningsplate eller strekplattemetode som beskrevet tidligere under 'Dyrking av bakterier'. Hver isolert koloni som finnes på en agarplate består av en art av bakterier, da hver koloni vokser fra en enkelt bakterie.

Således isoleres bakterier på agarplater ved to teknikker som følger:

(a) Spread plate teknikk

(b) Streak plate teknikk

Representative kolonier (kolonier med ulik karakteristikk) er valgt og aseptisk inokulert for å skille agar-skråninger for å få de rene kulturer. Etter hver 15 til 30 dager overføres de til ferske skråninger for vedlikehold av disse rene kulturer.

Materialer som kreves:

Testrør (5 nos.), 250 ml konisk kolbe (1 nei), 0, 1 N NaOH, 0, 1 N HCI, destillert vann, nærings agar, ikke-absorberende bomull, sløyfe, håndpapp, tråd (eller gummibånd), pH-papir (eller pH-meter), bunsenbrenner, autoklav, laminært strømningskammer, inkubator, plater som inneholder isolerte kolonier av bakterier (sprekkeplate eller strekplate).

Fremgangsmåte:

1. Ingrediensene av nærings agar medium eller dets ferdige pulver som kreves for 100 ml av mediet, veies og oppløses i 100 ml destillert vann i en 250 ml konisk kolbe ved risting og virvling (figur 6.4).

2. pH-verdien bestemmes ved bruk av pH-papir eller pH-meter og justeres til 7, 0 ved bruk av 0, 1N HC1 hvis det er mer eller ved bruk av 0, 1N NaOH hvis det er mindre.

3. Kolben oppvarmes for å oppløse agaret i mediet helt.

4. Før det størkner, fordeles mediet i varm smeltet tilstand i 5 reagensrør (ca. 20 ml hver).

5. Testrørene er bomullspluggede, dekket med håndflate og festet med tråd eller gummibånd.

6. De blir sterilisert ved 121 ° C (15 psi trykk) i 15 minutter i en autoklav.

7. Etter sterilisering fjernes de fra autoklaven og holdes i skrå stilling for å avkjøle og størkne mediet. Disse reagensrørene som inneholder størknet næringsmiddel agar medium i skrå tilstand kalles "næringsmiddel agar skråninger".

8. Trinn 10 og 11 bør utføres etter aseptisk teknikk, fortrinnsvis i et laminært strømningskammer. Munnen av beholderne som inneholder steriliserte medier eller kulturer skal vises over flammen av bunsenbrenner etter at du har fjernet bomullspluggen, og før du legger den tilbake.

Looper, før bruk, må steriliseres over flamme ved oppvarming til rødt og deretter avkjøling i 30 sekunder for å avkjøles til romtemperatur. De bør aldri brukes når det er veldig varmt, da de dreper mikroberene når de berører dem.

9. I det foregående eksperimentet, hvis isolerte kolonier kunne observeres på spredplaten eller strekplaten, blir fem kolonier med forskjellige egenskaper valgt som representative kolonier.

10. En sløyfe steriliseres over flamme og en sløyfe av bakterier fra hver av de representative koloniene tas aseptisk. Sløyfen er introdusert i agarskråningen, slik at bakteriebøyningen går til slutten av skråningen. Sløyfen flyttes utover på en bølget måte som berører overflaten av skråningen, slik at en bølgete linje dannes.

11. Sløyfen er flamsterilisert og på lignende måte inokuleres resten av de fire representative koloniene separat til venstre over fire skråninger. Sløyfen steriliseres etter hver inokulasjon.

12. De fem podede slanger inkuberes ved 37 ° C i 24 timer i en inkubator.

Observasjoner (kulturelle egenskaper):

(i) En bølgete linje med vekst langs dens lengde observert:

Vekst har skjedd.

Skråningen er observert for skrå egenskaper som følger (figur 6.5).

1. Overflod av vekst:

Mengden vekst er betegnet som ingen, liten, moderat eller stor.

2. Pigmentering:

Kromogene mikroorganismer kan produsere intracellulære pigmenter som er ansvarlige for fargen av organismen som sett i overflatekolonier. Andre organismer produserer ekstracellulæroppløselige pigmenter som utskilles i mediet og produserer også en farge. De fleste organismer er imidlertid ikke-kromomere og vil fremstå hvite til grå.

3. Optiske egenskaper:

Optiske egenskaper kan vurderes på grunnlag av mengden lys som sendes gjennom veksten.

Disse egenskapene er beskrevet som:

(en) Ugjennomsiktig: Ingen lysoverføring.

(B) Gjennomsiktig: Delvis lysoverføring.

4. Skjema:

Utseendet til enkeltlinjens strekk av vekst på agaroverflaten er betegnet som følger:

(en) Filiform: Kontinuerlig, trådaktig vekst med glatte kanter.

(B) Echinulate: Kontinuerlig, trådaktig vekst med uregelmessige kanter.

(D) Effuse: Tynn, spre vekst.

(E) Arborescent: Tree-lignende vekst.

(f) Rhizoid: Rotlignende vekst.

(ii) Ingen vekst langs injeksjonslinjen:

Feil teknikk for inokulering, Inokulering gjentas. C Oppregning av bakterier.

C. Oppsummering av bakterier:

Omfanget av bakteriell aktivitet i en gitt prøve i et bestemt sett av forhold, avhenger hovedsakelig av det totale antall bakterier som er tilstede i det, uavhengig av deres art. Derfor er det svært ofte nødvendig å finne ut totalt antall bakterier tilstede i prøver av mat, vann, jord, luft og vev under mikrobiologisk analyse.

Estimering av antall bakterier i en gitt prøve kalles 'oppregning av bakterier'. Det finnes ulike metoder for oppregning av bakterier som angitt nedenfor. Alle disse metodene trenger bakterier til å være tilstede i en homogen suspensjon.

Det antas derfor at flytende prøver er homogene suspensjoner av bakterier og brukes direkte, mens faste prøver homogeniseres i sterile saltoppløsninger for å få homogene suspensjoner av bakterier.

Ikke brukt vanligvis:

(I) Direkte Metoder:

(a) Direkte mikroskopisk telling

(b) Elektronisk celleteller

(II) Indirekte metoder:

(D) Turbidimetrisk metode

(E) Membranfiltertelling

Mest brukte:

(f) Serial fortynning-agar plating metode eller Total Plate Count Metode (TPC metode)

(a) Direkte mikroskopisk antall:

I denne metoden teller antall bakterier tilstede i en alikvot av den homogene suspensjon av bakterier direkte under et mikroskop, og det totale antall bakterier i prøven bestemmes matematisk.

Fordelen med denne metoden er at den er veldig rask. Ulempene er at både levende (levedyktig) og døde celler regnes og metoden er ikke følsom for populasjoner med færre enn en million bakterier per milliliter.

Telling kan gjøres i to metoder som følger:

(i) Petroff-Hauser-kammeret:

Det er et spesialisert tellekammer, hvor en alikvot av den homogene suspensjonen av bakterier blir satt til å telle direkte under et mikroskop.

(ii) Breed Smear:

Bakterieceller regnes direkte under mikroskop ved bruk av flekkede smører begrenset til et område på 1 mm ² på lysbildet. Det brukes hovedsakelig til oppregning av bakterier i melk.

(b) elektronisk celleteller:

En elektronisk celleteller som "Coulter counter" brukes til å regne direkte antall bakterieceller. En homogen suspensjon av bakterieceller fremstilt i en ledende fluid får lov til å passere gjennom en minuttåpning, over hvilken en elektrisk strøm strømmer.

Motstanden ved åpningen er elektronisk registrert. Når en celle passerer gjennom åpningen, er ikke-leder, øker motstanden øyeblikkelig. Antall ganger motstanden øker øyeblikkelig, registreres elektronisk, noe som indikerer antall bakterier tilstede i suspensjonen.

Fordelen med denne metoden er at den er ekstremt rask. Ulempene er at både levende (levedyktig) og døde celler telles og instrumentet kan ikke skille mellom bakterieceller og inert partikkelformet materiale.

(c) Kjemiske metoder:

Disse metodene estimerer mengden av disse stoffene, hovedsakelig kjemikalier, som øker med økningen i bakteriepopulasjonen.

De viktigste parametrene estimert er som følger:

(i) Proteinkonsentrasjon

(ii) DNA-konsentrasjon

(iii) tørrvekt

(iv) Kullsyreproduksjon

(v) oksygenopptak

(vi) Melkesyreproduksjon

(d) Turbidimetrisk metode:

Når bakterier vokser i flytende næringsrike medier (f.eks. Næringsvæske), gir deres kraftige vekst media uklarheten, siden bakteriene celler for det meste forblir suspendert i dem. Turbiditeten øker med økning i antall celler i media. Når turbiditeten øker, øker mediaens "absorbans" eller "optisk tetthet (OD)".

OD av suspensjonen av bakterieceller i media måles ved bruk av et spektrofotometer ved 600 nm. Antall bakterieceller i suspensjonen er funnet ut ved å sammenligne OD med en standardkurve fremstilt ved å plotte OD-verdiene for forskjellige kjente konsentrasjoner av bakterier. Metoden er rask, men begrenset til bakterielle suspensjoner på mer enn 10 millioner celler.

(e) Membranfiltre:

Denne metoden brukes når antall bakterier i en væskeprøve er meget mindre. For å øke konsentrasjonen av bakterier, blir først væskeprøven filtrert aseptisk gjennom et sterilisert membranfilterapparat ved bruk av et sterilt membranfilter.

Membranfilteret som inneholder de fangne bakteriene overføres aseptisk til en steril petriskål som inneholder en absorberende pute mettet med et selektivt differensielt flytende medium. Mediumet oser på overflaten av filteret. Etter inkubasjon teller antall kolonier dannet på filteret ved hjelp av et enkelt mikroskop.