Neutrofile funksjonsanalyser
Neutrofile Funksjon Assays!
1. Kjemotaksier av nøytrofiler kan vurderes ved hjelp av følgende metoder:
en. Modifisert Boyden kammeranalyse:
Boyden-kammeret består av et øvre og et nedre kammer adskilt av et filter med liten porestørrelse.
Neutrofile suspensjonen er plassert i det øvre kammer og en kjemotaktisk substans plasseres i det nedre kammer. Graden av neutrofilmigrasjon vurderes ved å telle antall nøytrofiler fanget i filteret og antall nøytrofiler i det nedre kammer ved hjelp av flytcytometri.
b. Brønner stanses ut i en halvfast agar:
Neutrofile suspensjon, kjemotaktisk substans og en ikke-kjemotaktisk substans er plassert i forskjellige brønner. Migrering av celler gjennom den halvfaste agar mot den brønnholdige kjemotaktiske substansen bestemmes mikroskopisk. Migrasjon mot den ikke-kjemotaktiske substansen representerer vel det tilfeldige bevegelsen av celler (kjent som chemo kinesis).
2. Neutrofile fagocytose:
En rekke partikler kan brukes til å vurdere nøyakrofils fagocytiske kapasitet. Partiklene inkuberes med nøytrofiler og senere observert mikroskopisk for nærvær av partiklene inne i nøytrofile. Celleoverflatede partikler fjernes med syrebehandling, slik at de celleoverflate partikler ikke regnes som intracellulære partikler.
Fluorescerende merkede eller radioaktive partikler som tillater direkte telling av partikler av fagocytter er også nå tilgjengelige.
3. Bestemmelse av luftveisspredning og degranulering:
Kronisk granulomatøs sykdom (CGD) er en immunsviktssykdom hvor den intracellulære drepingen av fagocytter påvirkes på grunn av manglende evne til fagocytiske celler til å produsere superoksidanion (O2-).
en. Nitroblue tetrazolium (NBT) lysprøve:
NBT er et klart, gult, vannløselig fargestoff. NBT er redusert til en dyp blå, formazon ved O 2 - . Neutrofiler aktiveres ved behandling med PMA eller eksponering for LPS. De aktiverte neutrofiler blir deretter inkubert med NBT. Hvis nøytrofilene produserer O 2 -, blir NBT redusert til dyp blå formazon og det visualiseres under mikroskop. En kvantitativ analyse kan utføres ved å ekstrahere formazon fra nøytrofilene og analysere formazonet ved hjelp av et spektrofotometer. Barn med fullstendig mangel på NADPH-oksidaseaktivitet viser en brutto mangel i NBT-testen. Men barn med delvis tap av NADPH-oksidaseaktivitet oppdages bedre ved kvantitativ analyse.
b. Flowcytometrisk analyse ved bruk av 2'7'-diklorfluorescein (DCF):
O2 - dannet under NADPH-oksidaseaktivitet omdannes til H202 ved enzym superoksiddismutasen. H 2 O 2 er en annen mikrobicid kjemikalie. H202 oksyderer den ikke-fluorescerende forbindelsen DCF til en fluorescerende forbindelse som detekteres av strømningscytometeret.
Fagocytter inkuberes med DCF og DCF går inn i cellene.
↓
Deretter aktiveres nøytrofilene av PMA eller andre midler.
↓
Deretter analyseres cellene i strømningscytometeret. En økning i florescensen av fagocytene bestemmes.
Flowcytometer tillater også kvantitativ bestemmelse av H202 produsert av individuelle celler. Følgelig er strømningscytometrisk analyse nyttig ved påvisning av partielle defekter i NADPH-oksidase-funksjon eller for screening for heterozygote bærere av den X-bundet form av CGD.
4. Fagocyt degranulering:
Fagocytisk degranulering er en prosess med fusjon av lysosomer med fagosomer, som fører til utslipp av lysosomalt innhold i fagolysosomet. Degranulering er en aktiv prosess og krever energi. Forringelsen av normale metabolske veier for nøytrofiler (spesielt oksygenforbruk og kjøttkjøtt av glukose gjennom heksosmonofosfat-shunt) forstyrrer degranulering; Følgelig påvirkes intracellulær dreping av mikrober av fagocytter.
Degranulering av fagocytter i en suspensjon kan induseres av forskjellige aktiveringsmidler og forbindelser som påvirker cytoskeletet i cellen (som cytokalasin B). Fagocytene frigjør hovedsakelig sekundære og tertiære granuler, og de måles ved hjelp av ELISA-metoder.
Jeg. Laktoferrin (et sekundært neutrofilt granulat) brukes som en markør for sekundær granulutløsning.
ii. Albumin analyseres som et mål for tertiær granulasjonsfrigjøring.
Assay for primærgranulfrigivelse fra fagocytter gjøres ved å lete etter frigjøring av primære granulater i lukkede rom. "Frustrert fagocytose" er en analyse som brukes til å vurdere frigjøring av primære granulater (figur 27.7).
Varme-aggregerte immunoglobulin eller immunkomplekser er festet til en petridish.
↓
Neutrofile blir tilsatt til petridish og inkubert. Gjennom Fc-reseptorene binder nøytrofilene seg til Fc-områdene av varmaggregnede immunoglobulin eller immunkomplekser. Følgelig forsøker nøytrofiliene å fagocytose de varmeaggregnede immunoglobulin eller immunkompleksene. Men nøytrofile kan ikke fagocytose dem (fordi de er festet til petriskålen). Følgelig frigjør nøytrofilene deres granulære innhold over dem.
↓
Graden av frigjøring av primære granulproteiner, så som myeloperoksidase eller p-glukoronidase, anvendes for å estimere degranuleringen. Mangler i syntesen av primære / sekundære granulater kan også detekteres ved å fargelegge intracellulære granulater med merkede mAbs og strømningscytometri.
Bakteriell drap av nøytrofiler:
Mikrobicide analyser er vanskelige å utføre. Generelt utføres mikrobicide analyser når enklere analyser ikke gir tilstrekkelig informasjon.
Staphylococcus aureus stamme 502A brukes ofte til å vurdere nøytrofiliens mikrobicide kapasitet.
Staphylococcus aureus stamme 502A vokser i logfase inkuberes med humant serum (for å gi immunoglobulin og komplementproteiner for å virke som opsoniner).
↓
Ferske isolerte nøytrofiler blir tilsatt ved en konsentrasjon på 5-10 bakterier / nøytrofile.
↓
Etter 30 minutters inkubering dør bakteriene som ikke er oppslukt av neutrofiler, ved tilsetning av legemiddel gentamicinet. (Gentamidn går ikke inn i nøytrofiler og dermed fagbevoktede bakterier forblir i live.)
↓
Alkvoter av nøytrofiler fjernes med 30 minutters intervaller og blandes med sterilt destillert vann for å lyse nøytrofilene og frigjøre bakteriene. Antallet levedyktige bakterier i hver alikvot måles ved seriell fortynning av og plating på blodagarplater.
↓
Resultatene er plottet på en graf.
Jeg. Normale nøytrofiler viser en to-log reduksjon i levedyktige intracellulære bakterier etter en times inkubasjon.
ii. Nesten det er ingen drap av nøytrofile fra homozygote CCD-pasienter.
iii. Neutrofiler fra heterozygote CGD-bærere viser delvis drep av nøytrofile.
