Transgene dyr: Målet med genoverføring med forskjellige transfeksjonsmetoder

Transgene dyr: Målet med genoverføring med forskjellige transfeksjonsmetoder!

Et transgen dyr inneholder i sitt genom, et gen eller gener introdusert ved en eller annen transfeksjonsteknikk.

Genet introdusert ved transfeksjon kalles et transgen. I dyr spesifiserer transfeksjon innføringen av et DNA-segment, enten nakent eller integrert i en vektor, inn i en dyrecelle.

Målet med genoverføring:

1. Genetisk modifikasjon av dyr kan være rettet mot å forbedre deres melk, kjøtt, ull, etc. produksjon.

2. Gener har blitt overført til dyr for å oppnå en storskala produksjon av proteiner kodet av disse gener i melk, urin eller blod av slike dyr.

3. Et spesielt tilfelle av genoverføring tar sikte på å lindre eller til og med eliminere symptomene og følgelig elendighetene i genetiske sykdommer. I denne tilnærmingen blir normale og funksjonelle kopier av det defekte genet innført i pasienten (genterapi).

4. Spesifikke transgene dyrestammer eller -linjer er opprettet for å oppfylle spesialiserte eksperimentelle og / eller biomedisinske behov.

Transfeksjonsmetoder:

Flere tilnærminger har blitt brukt for innføring av DNA i dyreceller / embryoer som er som følger:

(i) Kalsiumfosfatutfelling.

(ii) Direkte mikroinjeksjon.

(iii) Retrovirusinfeksjon.

(iv) lipofeksjon.

(v) Partikkelpistol levering og

(vi) Elektropoiering.

Kalsiumfosfatutfelling:

I denne tilnærming oppløses DNA-preparatet som skal anvendes for transfeksjon først i en fosfatbuffer. Kalsiumkloridoppløsning blir så tilsatt til DNA-løsningen; Dette fører til dannelsen av uoppløselig kalsiumfosfat som samfellerer med DNA. Kalsiumfosfat-DNA-utfellingen blir tilsatt til cellene som skal transfekteres.

Bunnfallspartiene tas inn av cellene ved fagocytose. I utgangspunktet ble 1-2% av cellene transfektert ved denne tilnærmingen. Men prosedyren er nå blitt modifisert for å oppnå transfeksjon av opptil 20% av cellene. I en liten andel av de transfekterte cellene blir DNA integrert i cellegenomet som produserer stabil eller permanent transfeksjon.

Denne generelle tilnærmingen kan brukes på praktisk talt alle pattedyrceller, og et meget stort antall celler kan behandles med liten innsats. Men mange cellelinjer liker ikke kalsiumfosfatutfellingen som festes til overflatene eller på substratet.

lipofeksjon:

Levering av DNA i celler ved bruk av liposomer kalles lipofeksjon. Liposomer er små vesikler fremstilt fra en egnet lipid. I utgangspunktet ble ikke-ioniske lipider anvendt for å fremstille liposomer slik at DNA måtte innføres i vesiklene etter spesifikke innkapslingsprosedyrer.

Bruken av kationiske lipider for konstruksjonen av liposomer er en klar fordel når DNA spontant og effektivt komplekser med disse liposomene, noe som gjør innkapslingsprosedyrer unødvendige. De kationiske liposomer har en enkelt lipid-dobbeltlagsmembran (unilamellar), og de binder effektivt til cellene. Sannsynligvis smelter de sammen med plasmamembranen og gir dermed DNA (kompleksert med dem) i cellene, noe som medfører transfeksjon.

Lipofeksjon er den valgte metode for transfeksjon av pattedyrceller in vitro. Det har også blitt brukt til å levere DNA til levende dyr ved direkte injeksjon eller intravenøs injeksjon. Kationiske liposomer har blitt brukt i intravenøs eller intratrakeal injeksjon i mus for ekspresjon av markørgener i lungene. Målrettet levering er også blitt demonstrert ved å inkorporere spesifikke ligandproteiner i liposommembranene.

Retroviral Infeksjon:

Rekombinante retrovirus produserer virioner som brukes til å infisere dyreceller og musembryoer. Det rekombinante retrovirus-RNA-genomet kopieres ved revers transkriptase for å gi en DNA-kopi (inntektstransskripsjon), som blir integrert i cellens genom. Omvendt transkriptase er kodet av retroviruset, og produseres umiddelbart etter infeksjon.

Imidlertid kan revers transkripsjonen bare forekomme i de cellene som går gjennom S-fasen, dvs. er mitotisk aktive. DNA-kopien av det rekombinante retrovirus integreres i det cellulære genomet på tilfeldige steder, og er vanligvis ikke ledsaget av deletjoner eller omlegginger.

mikroinjeksjon:

I denne metoden injiseres DNA-oppløsning direkte i kjernen til en celle eller inn i mannlige pronucleus av et befruktet en til to-cellet egg. Vanligvis består en mikroinjeksjonssammenstilling av et lavmakt stereoskopisk disseksjonsmikroskop (for å se ovum og hele prosessen) og to mikromanipulatorer, en for en glassmikropipett for å holde egget ved delvis suging og den andre for en glassinjeksjonsnål for å introdusere DNA i mannlige pronucleus. Den mannlige pronucleus er mye større enn den kvinnelige pronucleus av befruktet pattedyr ova. Imidlertid injiseres DNA i eggcytoplasma i fiskeovne.

Den generelle prosedyren for mikroinjeksjon er som følger: Donorhunner er indusert til super-eggløsning ved hjelp av passende hormonbehandlinger. De superovulerte hunnene blir deretter parret med fruktbare hanner, og store mengder befruktet en eller tocelle egg / embryoer samles kirurgisk. Alternativt blir unfertilized egg hentet fra super-eggede kvinner; egget befruktes deretter in vitro. Transgenkonstruksjonen blir fremstilt i en bufferløsning og injiseres i hanproteinet av befruktede egg ved hjelp av en mikroinjeksjonsanordning.