Nylige fremskritt i diagnostikk av malaria

Nylige fremskritt i diagnostikk av malaria - HL Gupta, VK Talwar, A Rohtagi!

Introduksjon:

I India er malaria et stort helseproblem; Det har vært hyppige utbrudd i Rajasthan og Nordøst-stater. I Rajasthan forekommer P. falciparum på en økning. I Delhi P. vivax er den vanligste arten, men også P. falciparum. Malaria, et verdensomspennende problem, dreper mellom 1, 5 og 2, 7 millioner mennesker hvert år. Med andre ord dreper det en person (ofte et barn <5 år) hvert 12. sekund. I tillegg er 300-500 millioner mennesker smittet med sykdommen hvert år.

For å kontrollere sykdommen er rask og presis diagnose viktigst. Malaria diagnose er ofte gjort bare på grunnlag av kliniske symptomer, selv om dens nøyaktighet er i beste fall 50 prosent. Nyere, avanserte diagnostiske teknikker er nå tilgjengelige. Nylig innførte undersøkelser basert på immunanalyse er raske (<10 min / test) og minst like følsomme som tradisjonell mikroskopi.

Lysmikroskopi: Tykt og tynt blodsmerter:

Den tradisjonelt aksepterte laboratorieprosedyren for diagnose av malaria har vært mikroskopisk undersøkelse Giemsa eller Field-stained blood smears. Ideelt sett bør blod oppnås med en fingerpinne; Imidlertid er blod oppnådd ved venepunktur og antikoagulert (EDTA eller heparin) akseptabelt dersom det undersøkes umiddelbart. Både tykke og tynne smører bør gjøres. Tykt smøring, konsentrerer røde blodlegemer 20 - 30 ganger på en liten overflate, øker følsomheten til teknikken og er mye bedre enn tynne smører. Tynt smøring er imidlertid mer spesifikt.

Det er den aksepterte gullstandarden for diagnose, men er arbeidskrevende, og tolkning av resultater krever betydelig kompetanse, særlig med lav parasitemi. I tillegg kan P falciparum parasitter som ofte er sekvestrert fra perifert blod, lett bli savnet.

Kvantifisering av parasitter ved undersøkelse av blodsmerter:

Det er mange metoder for å kvantifisere malarial parasitter i tykke smører. Parasittnivåer kan også kvantifiseres ved undersøkelse av et tynt blodsprøyt. En stor ulempe ved tykke smører er at det ofte krever en viss grad av kompetanse som kan være utilgjengelig.

Teoretisk bør undersøkeren telle tykkfeltfelt som inneholder 20 eller flere leukocytter / hpf. I virkeligheten er felt som inneholder 20 eller flere leukocytter for tykk til å telle, mens felt som er enklest å lese er de som inneholder bare fem eller seks leukocytter / hpf.

Før farging skal undersøkeren kunne lese utskrift gjennom et godt forberedt, tykt blodsprøyt. Undersøkelse av tynne smører er bare en tiendedel så følsom som undersøkelse av tykke smører. Selv om undersøkelse av blodsmerter er akseptabelt som universell, "gullstandard", er det således ingen enkel standardmetode, som brukes av alle etterforskere, for kvantifisering av parasitter ved å telle parasitter i tykke smører.

I tillegg, under utdannet personale, begrenser mangel på mikroskoper bruken av blodsprøveundersøkelse i mange endemiske områder. Erkjennelsen av disse begrensningene er det utviklet alternative teknikker for diagnose av malaria.

Fluorescerende mikroskopi:

Tre fluorescerende teknikker holder løfte om diagnose av malaria.

Disse er:

(i) Den kvantitative buffy-coat (OBC) metoden som er tilgjengelig som et kommersielt sett

(ii) Kawamoto Acridine Orange (AO) prosessen og

(iii) Benzotiokarboxypurin (BCP) prosedyre.

Disse tre teknikkene er raske og enkle å utføre; Når det er mer enn 100 parasitter / μL, demonstrerer de følsomhet og spesifisitet som tilsvarer de som oppnås ved tykk smøring.

Både OBC og Kawamoto-metoder bruker akridinorange (AO) som fluorokrom til å flekke nukleinsyrene av malarial parasitter i en prøve. BCP er også en fluorokrom som flekker nukleinsyrer. AO er uspesifikk og smelter nukleinsyrer fra alle celletyper.

Derfor må undersøkeren lære å skille fluorescerende farget parasitter fra andre celler og cellulære rusk. Følsomhet av AO-farging med parasittnivåer på mindre enn 100 parasitter / μL har vært 41, 7-93 prosent.

Specificitet av AP-farging for P. vivax og P. falciparum er henholdsvis 52 og 93 prosent. BCP-metoden har en sensitivitet og spesifisitet på mer enn 90 prosent. Viktig begrensning av metoder basert på AO og BCP er deres manglende evne til å skille mellom Plasmodium-arter. AO er farlig og krever spesielle avhendingskrav.

OBC og BCP er mer krevende teknisk enn Kawamoto. Kawamoto og AO metoder krever spesialutstyr og forsyninger og er dyrere. Prisen på et fluorescensmikroskop kan være en begrensende faktor for laboratorier som er interessert i å utnytte disse metodene.

Påvisning av spesifikke nukleinsyresekvenser:

Deteksjon av nukleinsyresekvenser som er spesifikke for Plasmodium parasitter, kan være nyttig. I PCR-baserte teknikker påvises forsterket målsekvens ved interne sonder eller analyseres ved gelelektroforese. Stor fordel ved å bruke en PCR-basert teknikk er evnen til å oppdage en lav parasitemi. Infeksjoner med levende parasitter kan detekteres med 100 prosent spesifisitet.

Imidlertid er slike teknikker dyre og arbeidskrevende, krever omfattende teknisk ekspertise, involverer flere trinn, og kan ikke brukes til å skille mellom levedyktige og ikke-levedyktige organismer.

PCR-hemmere som er naturlig tilstede i blodprøver, kan resultere i et betydelig antall falsk-negative resultater. Falske positive resultater, på grunn av overføringskontaminering, har også blitt registrert.

PCR-baserte teknikker har blitt brukt til å skjerme givere i et område der malaria er endemisk. Følsomheten og spesifisiteten av PCR-baserte metoder, estimert ved bruk av undersøkelse av blodutsprøytninger som "gullstandarden", er hver 90 prosent eller mer.

I tillegg kan videre fremskritt i PCR-teknologien snart gi mulige parasitter til å skille seg fra ikke-gunstige. For tiden er bruken av slik teknologi begrenset av behovet for dyre, spesialisert laboratorieutstyr, personell opplært i genetisk teknologi og "clean room" -anlegg, og med høye kostnader for enzymer og primere som brukes.

Antigen Deteksjon:

Antistoff-deteksjonstester for malaria var begrenset i følsomhet og deres evne til å skille aktiv fra tidligere infeksjoner. Den nye generasjonen, antigen-fangst tester er i stand til å oppdage færre parasitter og å produsere raske resultater (10-15 minutter). De er kommersielt tilgjengelige sett, som inkluderer alle nødvendige reagenser, og krever ikke omfattende trening eller utstyr.

Det er to parasittantigener som brukes i de nye, hurtige, diagnostiske testene, histidin-rik protein-2 (HRP-2), som bare produseres av P. falciparum og parasitt laktat-dehydrogenase (pLDH) antigen, produsert av alle fire plasmodium arter smittende mann. Begge antigenene utskilles i blodet av alle aseksuelle stadier av parasitten; pLDH antigenet produseres også av gametocytter.

De nyeste antigenoppsamlingsprøvene er raske og enkle å utføre, og har gjenkjenningsgrenser som kan sammenlignes med mikroskopi av høy kvalitet (dvs. 100-200 parasitter / μL). Når det er mer enn 60-100 parasitter / μL, vil HRP- 2 baserte tester er høyt (> 90%) sensitive og (> 90%) spesifikke, sammenlignet med tykk smearmikroskopi.

For tiden er to slike tester kommersielt tilgjengelige, ParaSight F-testen og IKT (immunokromatografisk) Malaria Pf Test. Begge testene utføres på fingerpiksprøver, og oppdager bare P. falciparum malaria.

De er basert på monoklonale antistoffer mot HRP-2, som er immobilisert på nitrocellulosestrimler, for å produsere dipsticks eller papptester (ICT Pf Test). I hver test indikeres et positivt resultat ved utseende av en rød linje på teststrimmelen, der de monoklonale antistoffene er immobilisert.

Begge testene inneholder også en innebygd kontroll; en kontrolllinje må vises for en test som anses som gyldig. Sensitivitet og spesifisitet av ParaSight F-testen er henholdsvis 88 og 97 prosent, sammenlignet med PCR.

Selv om HRP-2-baserte serologiske tester har muliggjort rask diagnose av falciparummalaria, har de begrenset brukervennlighet. Siden HRP-2 bare er tilstede i P. falciparum, er tester basert på påvisning av HRP-2 negative med infeksjon forårsaket av vivax, oval eller malaria.

Mange tilfeller av ikke-falciparum malaria vil derfor bli misdiagnostisert som malaria-negativ. En annen begrensning av HRP-2-baserte tester er at HRP-2 vedvarer i blod lenge etter at kliniske symptomer er forsvunnet og parasittene tydeligvis slettes fra verten.

Faktisk har HRP-2 blitt oppdaget i mumier. Testene for dette antigenet kan derfor ikke være nyttige for screening av individer til individer til endemiske områder, som kan ha vedvarende parasittemi på lavt nivå. Den mulige årsaken til persistens av HRP-2 antigen er ikke godt forstått; Det kan gjenspeile nærvær av latente, levedyktige parasitter (muligens et resultat av behandlingssvikt) eller av oppløselige antigen-antistoffkomplekser.

Persistensen kan også avhenge av hvilken type anti-malarial terapi som er innført. HRP-2-signalet kan vedvare i 19 dager etter tilsynelatende effektiv kinin og doxycyklinbehandling. Også vedvarende HRP-2 antigenemi er observert under og etter artemeterbehandling.

Andre begrensninger er spesielt knyttet til tekniske aspekter av HRP-2-systemet. For eksempel kan monoklonal IgG brukt i ParaSight F-systemet krysse reagerer med reumatoid faktor og forårsake en falsk positiv respons.

IKT Pf-testen benytter et monoklonalt IgM, som ikke kryssreagerer, og det foreligger ikke rapporter om falske positive reaksjoner som forekommer med denne testen på grunn av reumatoid faktor. IKT Pf-testen krever imidlertid lagring ved 4 ° C, noe som begrenser bruken i feltforhold.

pLDH-baserte serologiske analyser:

De nyeste raskeste serologiske testene for diagnose av malaria er basert på deteksjon av pLDH. I likhet med HRP-2-baserte analyser er disse testene følsomme, spesifikke og enkle å utføre, med resultater oppnådd på mindre enn 15 minutter.

De pLDH-baserte analysene er også i stand til å skille mellom P. falciparum og andre Plasmodium-arter, og siden pLDH kun produseres av levedyktige parasitter, er de også nyttige i overvåking av anti-malarial terapi. pLDH fra P. falciparum er differensiert fra verten LDH (h-LDH) med 3-acetylpyridin-adenin-dinukleotid (APAD), en analog av Nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD).

De pLDH-baserte analysene er tilgjengelige i to former, en halvkvantitativ, tørr, peilstift (OptiMAL); og en kvantitativ, immuno-enzymatisk fangstanalyse. OptiMAL-analysen bruker to monoklonale antistoffer, en spesifikk for P. falciparum og den andre som anerkjenner alle 4 Plasmodia.

Den testte blodprøven (10 μl fingerpinne, helblod eller frosset hemolysat) blandes med 3oμL, lyseringsbuffer inneholdende konjugert monoklonalt antistoff. Denne blandingen får lov til å suge inn i OptiMAL, peilepinnen.

Etter 3 minutter tilsettes 100 μl rydningsbuffer. Hvis P. falciparum er tilstede i blodprøven, utvikles tre linjer (inkludert en, på toppen av hver pinne som representerer den positive kontrollen) på dipsticks.

To linjer indikerer P. vivax, P. malariae eller noen ganger P. ovale. En nyformatert OptiMAL-2-strimmel har tre testlinjer og en positiv kontrolllinje som gjør at alle fire Plasmodium-arter kan identifiseres.

Hver test anses bare ualid hvis kontrolllinjen utvikler seg. De monoklonale antistoffene som ble benyttet i OptiMAL-testen, har blitt uttømmende testet for kryssreaktivitet med LDH fra leishmania, babesia og patogene bakterier eller sopp, og det har ikke blitt funnet noe tegn på slik kryssreaktivitet.

HRP-2 ble funnet å fortsette godt etter at perifer parasitemi hadde ryddet. Selv om pLDH-nivåer følger tett perifert parasitemi og faller til uoppdagelige verdier 3-5 dager etter kinin og doxycyklinbehandling, falt nivåene av HRP-2 antigen bare etter 19 dager, godt etter at pasienten er symptom og tilsynelatende parasittfritt.

OptiMAL-analysen bør derfor være et verdifullt verktøy for overvåkning av anti-malarial terapi. Avklaring av parasitemi og clearance av pLDH ser ut til å være parallell med hverandre.

OptiMAL analyser, er svært allsidig. OptiMAL-testen har henholdsvis 94-88 prosent sensitivitet og spesifisitet på henholdsvis 100 og 99 prosent for henholdsvis P. vivax og P. falciparum, sammenlignet med blodprøver.

Denne testen kan brukes som et epidemiologisk verktøy siden i områder hvor mer enn en art av Plasmodium sirkulerer, kan den brukes til å identifisere Plasmodium-artene som infiserer pasienter i hver landsby raskt og la folkhelsearbeidere gi den mest hensiktsmessige kjemoterapi .

konklusjoner:

I løpet av de siste årene har arbeidet med å erstatte den tradisjonelle og kjedelige lesningen av blodpropper (en metode utviklet for nesten 100 år siden) ført til teknikker for påvisning av malarial parasitter som gir sensitivitet tilsvarende eller bedre enn mikroskopi.

Selv om PCR-baserte metoder er uten tvil den mest følsomme, er de så kostbare og trenger slik spesialisert utstyr og trening at de usannsynlig ikke vil bli brukt til rutinemessig diagnose i de fleste utviklingsland.

De er spesielt nyttige for studier av belastningsforskjeller, mutasjoner og gener som er involvert i stoffresistens i parasitten, og å vise nivået av relaterthet mellom stammer forbundet med forskjellige utbrudd av malaria. Den mest lovende, nye malariadiagnostikken er de serologiske målepinnene.

Disse testene, inkludert ParaSight F, ICT Pf Test og OptiMAL, er enkle å bruke, enkle å tolke og gir resultater i 15 minutter eller mindre. Disse testene er nesten like følsomme som mikroskopisk undersøkelse av blodpropper, men krever ikke høyt kvalifisert personell å utføre eller tolke resultater.

OptiMAL-testen har de ekstra fordelene ved å kunne detektere alle fire Plaspiodium-arter og følge effekten av medisinering, siden den måler et enzym produsert bare av levende parasitter.

Selv om dipstick-testene har to åpenbare begrensninger, bør det heller ikke forhindres at disse testene mottar utbredt aksept. Den første begrensningen er følsomheten. De tre aktuelt markedsførte analysene har sensitivitetsterskler på 50-100 parasitter / μ1. Følsomheten for prøver med <50 parasitter / μL er konsekvent 50% -70%.

Dette følsomhetsnivået kan ikke være mye av et problem for de som bor permanent i endemiske områder, som ofte ikke blir behandlet med mindre de har mer enn 500 parasitter / μL blod, men kan utgjøre et problem i diagnosen malaria hos de individer som er fra ikke-endemiske områder, men lever, arbeider eller reiser i endemisk område.

Som det store flertallet av malariapasienter har nivåer av parasitter godt over 50 parasitter / μL, vil enkelte pasienter imidlertid bli feildiagnostisert dersom peilprøven ble brukt rutinemessig. Den andre begrensningen av slike tester, i det minste for øyeblikket, er deres kostnad.

Verdens helseorganisasjon vurderer at diagnostiske tester for malaria koster mindre enn US $ 0, 40 / prøve for de som er i endemiske områder for å dra nytte av dem. Med mindre dipstick-testene produseres i massive tall, er denne prisen uoppnåelig og ikke praktisk for produsentene å møte.

De nåværende kostnadene for målepinntestene avhenger av kjøperens beliggenhet og volumet som er bestilt. For eksempel varierer kostnadene til IKT Pf-testene fra US $ 1, 30 / test i utviklingsland. Para 0Sight F-testene selger for US $ 1, 20 / test. Den optimale stripen selger for øyeblikket for US $ 3, 00 / test.