Eksperiment for å isolere kolofon av et virus (med diagram)

Eksperiment for å isolere kolofon av et virus!

Prinsipp:

Bakteriofagen eller faget (viruset) som infiserer bakteriene, Escherichia coli kalles colifag (coli: E. coli, fag: bakteriofag).

Det kan hentes fra en rekke naturlige kilder, som jord, fecal matter og rått kloakk. Isolasjonen fra disse kildene er ikke veldig lett, da den er tilstede i lav konsentrasjon.

Derfor blir dets nummer først økt ved et anrikningstrinn, hvor en rik kultur av vertsbakteriene (dvs. E. coli) blir tilsatt til den kolifagholdige prøve og inkubert. Kolifagen infiserer E. coli og øker i antall kraftig. Denne coliphagerike kulturen blir sentrifugert for å slå seg ned i det partikulære materiale.

Sedimentet kastes og supernatanten filtreres gjennom mikrobialfilter for å beholde bakterier og andre partikler, samtidig som koliphagen passerer gjennom. Filtratet, rik på colifage, brukes til å frøke en suspensjon av E. coli, som deretter får vokse som en sammenflytende plen på en agarplate.

Coliphagen vokser i E. coli-cellene og lyser dem. Lysis av bakteriecellene resulterer i dannelsen av klare soner på den sammenflytende plenen av bakterier. Disse klare sonene kalles plaketter. Hver klar sone antas å bli dannet av en enkelt kolifage.

Materialer som kreves:

Pipetter, koniske kolber, petriskål, reagensrør, bomullsplugger, bunsenbrenner, disponere krukke, sentrifuge, membranfiltreringsapparat, laminarflytningskammer, autoklav, inkubator, bakteriofagbuljong, tryptonmjuk agar, tryptonhard agar, næringsbuljongkultur av bakterier Escherichia coli (f.eks. E. coli B), prøve (f.eks. rå kloakk).

Fremgangsmåte:

1. Fem pipetter (i en rustfritt stålpipettveske) og fem petriskål steriliseres i en varmluftsovn ved 180 ° C i 3 timer. Alternativt kan de dekkes med fagpapir, bundet med tråd eller gummibånd og steriliseres i en autoklav sammen med mediene (figur 8.5).

2. Ingrediensene i bakteriofag-kjøttmedium eller dets ferdige pulver, som kreves for 100 ml av mediet, veies, oppløses i 100 ml destillert vann i en 250 ml konisk kolbe og pH justeres til 7, 6. Kolben er bomullskoblet, dekket med håndflate og festet med tråd eller gummibånd.

3. Ingrediensene av trypton-mykt agar-medium eller dets ferdige pulver, som kreves for 100 ml av mediet, veies, oppløses i 100 ml destillert vann i en 250 ml konisk kolbe og pH justeres til 7, 5.

4. Dette flytende medium er fordelt i 5 reagensrør (2 ml hver), bomullskoblet, dekket med håndflate og festet med tråd eller gummibånd.

5. Ingrediensene av trypton-hard agar-medium eller dets ferdige pulver som kreves for 100 ml av mediet, veies og oppløses i 100 ml destillert vann i en 250 ml konisk kolbe ved oppvarming etter pH-justering til 7, 5. Kolben er bomullskoblet, dekket med håndflate og festet med tråd eller gummibånd.

6. Kolben som inneholder bakteriofagbuljong, de 5 tryptonbløde agarrørene, kolben inneholdende tryptonhard agar-medium og en tom bomullsplugg 250 ml konisk kolbe steriliseres ved 121 ° C (15 psi trykk) i 15 minutter i en autoklav.

7. Det steriliserte trypton-hårde agarmediet i den koniske kolbe helles i de 5 steriliserte petriskålene aseptisk og får avkjøles for å få 5 trypton-harde agarplater.

8. I den bomullspluggede, steriliserte, tomme 250 ml koniske kolbe, 5 ml sterilisert bakteriofagbuljong, 5 ml E. coli B-buljongkultur og 45 ml rå kloakk overføres aseptisk, fortrinnsvis i et laminært strømningskammer (figur 8.6) .

9. Kolben inkuberes ved 37 ° C i 24 timer, slik at koliphagen i avløpet kan proliferere i vertsbakteriecellene (celler av E. coli B).

10. Innholdet i kolben helles i 100 ml sentrifugerør og sentrifugeres ved 2500 rpm i 20 minutter i en sentrifuge for å slå ned partiklene. Sedimentet blir kassert.

11. Supernatanten, rik på colifage, filtreres gjennom et membranfiltreringsapparat. Residuet blir kassert.

12. De fem steriliserte tryptonbløde agarrørene blir tatt og oppvarmet på et vannbad til 100 ° C for å smelte agaret. Rørene avkjøles og holdes ved 45 ° C på et vannbad.

13. Ved hjelp av en steril pipette overføres 1, 2, 3, 4 og 5 dråper av det bakteriefri filtratet, rik på colifag, aseptisk til de fem tryptonbløde agarrørene.

14. Til hvert trypton-mykt agarrør overføres 0, 1 ml av en næringsbuljongkultur av Escherichia coli B aseptisk.

15. Innholdet i de fem tryptonbløde agarrørene som har viruset, colifagen og bakteriene, E. coli B, blandes raskt ved å rotere rørene mellom håndflatene.

16. Innholdet helles over de fem trypton-harde agarplater (merket 1 til 5 dråper), hvorved det dannes et dobbeltlagsplaterkulturpreparat. Platen svirles forsiktig og får herdes.

17. De inokulerte platene inkuberes i en omvendt stilling ved 37 ° C i 24 timer i en inkubator.

observasjoner:

1. Alle platene blir observert for plakkdannende enheter (PFUer) som utvikler seg som klare soner på bakterieplenen. Plakkdannelse er indikativ for forekomst av colifag i kulturen.

2. Hver plakett representerer en rik vekst av isolert coliphage.

3. Antall plakk teller i alle platene og tabuleres som følger (Tabell 8.1).

Tabell 8.1: Observasjoner av antall coliphage :