Eksperiment for å utføre Gram-farging av bakterier (med figur)

Les denne artikkelen for å lære om eksperimentet for å utføre gramfarging av bakterier for å finne ut om det er gram-positivt eller gram-negativt!

Hensikt:

Den viktigste differensielle fargingen som brukes i mikrobiologi er gramfarvning.

Det er oppkalt etter Dr. Christian Gram som kategoriserte bakterier, basert på forskjellene i sammensetningen av deres cellevegg, i to grupper som følger:

(1) Gram-positive bakterier:

Etter å ha farget en bakterie med krystallviolett, hvis cellevegget motstår avfarvning ved å vaske med et avfargingsmiddel (etanol eller aceton), er det en gram-positiv bakterie. Eksempler: Bacillus, Staphylococcus.

(2) Gram-negative bakterier:

Etter å ha farget en bakterie med krystallviolett, hvis celleveggen lar seg avfarges ved vasking med et avfargingsmiddel (etanol eller aceton), er det en gram-negativ bakterie. Eksempler: Escherichia, Salmonella, Vibrio.

Differensiering av bakterier til gram-positive og gram-negative grupper gir det viktigste ledetråd for å fortsette videre i riktig retning for identifisering av ukjente bakterier. Det er også nyttig for enkel differensiering av bakterier til gram-positive og gram-negative grupper. Det gir også en ide om formen og arrangementet av bakteriecellene.

Prinsipp:

I gramfarging blir bakteriecellene først farget med en primær flekk, krystallviolett som kommer inn i cellene og flekker dem lilla-blå. Derefter behandles cellene med et mordant, grams jod, som kommer inn i cellene og binder til den primære flekken som danner et uoppløselig fargemordskompleks (krystallviolett-jodkompleks), hvilket gjør flaskens flukt vanskelig.

Deretter behandles cellene med et avfargingsmiddel, så som etanol eller aceton. Det virker som et lipidløsningsmiddel og som et proteindehydreringsmiddel. I gram-positive celler virker avfargingsmiddelet i utgangspunktet som et lipidløsningsmiddel, oppløsning av den lille mengde lipid som er til stede i celleveggen, og danner derved småporer i den. Deretter dehydrerer de celleveggproteiner (peptider) som lukker porene.

Nå er det vanskelig å fjerne fargemordskomplekset av avfargingsmiddelet og cellene beholder den fargeblå fargen til den primære flekken. Når motfargede av en rosa-farget flekk, safranin, kan den ikke komme inn i cellene, ettersom porene har blitt lukket.

Cellene beholder endelig den purpurblå fargen til den primære flekken. På den annen side inneholder den gramnegative celleveggen stor mengde lipid (LPS), som oppløses av avfaringsmiddelet, hvilket resulterer i dannelse av store porer. Disse porene lukker ikke betydelig på dehydrering av celleveggproteiner.

Det er hvorfor; flekkmordantkomplekset rømmer gjennom porene, når det vaskes av avfargingsmiddelet og cellene virker fargeløse. Når motfarget av safranin, går det inn i cellene gjennom porene og til slutt tar cellene den rosa-røde fargen på motfargene.

Materialer som kreves:

Slide, sløyfe, primær flekk (krystallviolett), mordant (grams jod), avfargingsmiddel (95% etanol), motfarging (safranin), buljong / skrå / platerkultur av bakterier, mikroskop, nedsenkningsløsning.

Fremgangsmåte:

1. Et lysbilde rengjøres ordentlig under vann fra springen, slik at vann ikke forblir som dråper på overflaten (Figur 5.11).

2. Det vedleggende vannet tørkes ut med bibulous papir og lysbildet lufttørkes.

3. Et smear av bakterier fremstilles i midten av lysbildet i to metoder som følger.

(en) Hvis en bakterie som vokser på agarplaten eller agarskråningen skal observeres, settes en dråpe vann i midten av lysbildet, og en sløyfe av bakterier fra platen eller skråningen overføres til den ved en sløyfe som er sterilisert over flammen. Deretter, ved langsom rotasjon av sløyfen i dråpen, blir en bakteriesuspensjon laget og spredes til et smear er oppnådd.

(B) Hvis en bakterie som vokser i væskebuljong, skal observeres, blir en dråpe av bakteriesuspensjonen plassert direkte i midten av lysbildet ved en flamme-sterilisert sløyfe og et smear er fremstilt ved spredning.

4. Smøret er lufttørket.

5. Smøret er festet ved oppvarming. Oppvarming resulterer i koagulering av de cellulære proteiner, som cellene holder seg til glidoverflaten til og ikke blir vasket bort under farging. Varmefiksering gjøres ved raskt å passere glidebryterne høyt over en flamme 2-3 ganger med smøret overflaten vender oppover, slik at smøret ikke blir oppvarmet.

6. Lysbildet holdes på en fargebrett og oversvømmes med den primære flekken, krystallviolett, i 1 minutt.

7. Overflødig flekk vaskes vekk fra smøret under forsiktig vann fra springen, slik at vannet ikke faller direkte på smeten.

8. Smøret er oversvømt med mordant, grams jod, i 1 minutt.

9. Overflødig mordant vaskes vekk fra smøret under forsiktig vann fra springen, slik at vannet ikke faller direkte på smeten.

10. Smøret er oversvømmet med avfargingsmiddelet, 95% etanol, i 5 sekunder, pass opp, slik at smøret ikke er over-avfarget.

11. Etanolet vaskes raskt bort fra smøret under forsiktig vann fra springen for å forhindre overfarging. Det tas vare på, slik at vannet ikke faller direkte på smøret.

12. Smøret er oversvømmet med motflaten, safranin, i 1 minutt.

13. Overflødig flekk vaskes bort fra smøret under forsiktig vann fra springen, slik at vannet ikke faller direkte på smeten.

14. Lysbildet blottes tørt med bibulous papir.

15. Lysbildet er klippet til mikroskopets stadium og smøret observert under lavt og høyt tørrmål.

16. En dråpe neddykkingsolje legges på smeten.

17. Smøret er observert under olje-nedsenkingsmål.